空腸彎曲桿菌生物膜形成和調控范文

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《微生物學報》2016年第二期

摘要：

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)分泌胞外多糖和各種胞外蛋白和核酸等相互交聯在一起構成生物膜，可增強其在不利環境下的生存率，尤其是對各種洗滌劑、抗生素和消毒劑的耐受力。本文從介質表面性質、溫度、氣體環境、以及基因的調控等多方面闡述了空腸彎曲桿菌生物膜結構及形成調控機制，同時對各種去除生物膜的實際應用做了分析和展望，為探尋生物膜的控制方法提供參考。

關鍵詞：

空腸彎曲桿菌,生物膜,調控機制

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是一種革蘭氏陰性的苛性營養菌，對溫度和氧氣濃度等環境條件要求很高，它不適宜生存在自然有氧的環境中。但事實上，它卻廣泛傳播，可以從食物、水源等途徑分離得到。那么它是如何克服各種不利因素，穿過食物鏈途徑，最終使得人和動物致病的呢？具體過程不得而知，但生物膜的形成對其保護作用不容忽視。生物膜是細菌之間通過彼此附著或是鑲嵌在自身分泌的胞外基質里面所形成的細胞團體結構，從形成到降解其過程分為5個階段[1]。研究表明，生物膜形成以后，其抗逆性大大增強，JoshuaGP等[2]證明生物膜態空腸彎曲桿菌可以在環境中存活比浮游態更久，對抗生素的耐性也增強。近年來，食品生產中關于控制生物膜的研究成為了熱點。本實驗室近年來開展了全國性食品中空腸彎曲桿菌的污染調查和風險識別研究，通過對污染進行追蹤和溯源分析，發現生物膜在空腸彎曲桿菌污染過程中充當重要角色，它保護空腸彎曲桿菌在不利環境中生存下來并在有利條件下釋放病菌。本文從空腸彎曲桿菌生物膜結構和形成、調控機理、以及生物膜的控制等方面對最新的研究進行歸納和總結，以期為相關研究和食品生產中控制污染提供參考。

1空腸彎曲桿菌生物膜的結構和形成

1.1空腸彎曲桿菌生物膜形態及鑒定空腸彎曲桿菌的生物膜有3種狀態：(1)在固體表面附著形成，比如聚苯乙烯、玻璃、鋼等介質表面；(2)在氣液表面形成薄膜；(3)在液體內部形成絮狀團塊[2]。目前主要采用結晶紫染色法[3]并結合掃描電子顯微鏡(SEM)和激光共聚焦電子顯微鏡(CLSM)法鑒定空腸彎曲桿菌生物膜。經過掃描電子顯微鏡觀察，這3種狀態均為相似結構。

1.2空腸彎曲桿菌生物膜形成的介質表面性質空腸彎曲桿菌生物膜一般都在與食品接觸的表面，比如不銹鋼、塑料等表面或是在動物飼養的供水管道內側。Ryan等[4]驗證各種食品生產過程可能遇到的介質表面包括親水性質玻璃和銅表面，以及疏水性質的聚苯乙烯塑料、ABS和PVC等發現，每種界面成膜能力不一致但疏水性界面較好。空腸彎曲桿菌的這種性質與單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等類似[5–7]。Victoria等[8]驗證木材、不銹鋼和玻璃3種物質發現木材表面最易成膜，可能是木材表面空隙可以卡住細菌和顆粒物質。Helen等[9]研究得到類似發現，有雞肉汁附著的不銹鋼表面更易形成空腸彎曲桿菌生物膜。總之，介質表面疏水性和粗糙度對空腸彎曲桿菌生物膜的形成非常重要。

1.3空腸彎曲桿菌生物膜形成的環境條件空腸彎曲桿菌生物膜的形成還與氧氣濃度、溫度、液體流速、營養物質以及細菌組成等環境條件相關。尤其是對溫度和氧氣濃度，Reuter等[10]通過實驗發現空腸彎曲菌菌株NCTC11168在大氣環境中比在微需氧時生物膜形成量高且更早。Asakura等[11]發現類似結果，但都只利用模式菌株NCTC11168。有趣的是，Ryan等[4]卻證明M129在越適宜生存的氧氣條件下越利于空腸彎曲桿菌生物膜形成。那么一般的空腸彎曲桿菌在氧氣壓力下生物膜形成是怎樣？Helen等[9]通過對NCTC11168以及其它4株受試菌實驗，發現在玻璃材質上5株受試菌在微需氧條件下生物膜形成能力均高于大氣條件，但在聚苯乙烯材質表面，這5株空腸彎曲桿菌卻一致有相反的結果，所以介質與氣體條件同時影響生物膜的形成。Dykes等[12]發現生物膜在4°C比在37°C形成能力強，但Ryan等[4]發現37°C形成能力高于25°C,可能是不同溫度時不同菌株形成能力不同的緣故，且對于研究空腸彎曲桿菌的溫度很多實驗設定在37°C，這個溫度既不是家禽體內定殖的最適溫度42°C，也不是一般食品生產過程中的合適溫度25°C，研究可能更多的需要考慮現實意義。營養物質也是影響空腸彎曲桿菌生物膜形成的重要原因。Ryan等[4]采用MHB、布氏肉湯和Bolton肉湯，發現在營養最貧乏的MHB中生物膜形成最多。且在添加各種不同程度增大滲透壓的物質，比如食鹽、葡萄糖等都會使生物膜大大減少，可能是滲透壓的改變影響空腸彎曲桿菌生長和繁殖，從螺旋桿狀變成圓球狀的活的不可培養(VBNC)狀態。生物膜靜態比動態容易形成，Joshua等[2]發現，在液體培養時，正常轉速80–100r/min下組織培養瓶內壁沒有細菌附著，而靜止培養時卻出現附著的生物膜。由此也給食品加工行業預防細菌生物膜的形成提供啟發。在自然界中，生物膜由多種不同細菌共同構成。生物膜的形成之初是主動粘附界面的階段。

空腸彎曲桿菌在混菌狀態下構成生物膜是否是生物膜最初的發起者呢？Sanders等[13]證明單一的空腸彎曲桿菌生物膜常在特定有利于它生長的狀況下才形成，因為在宿主體外，它對環境的耐受力很弱，成為原發性定殖形成生物膜的可能性很小。Hanning等[14]也證明了這個觀點，并且發現過程中沒有發生細胞間的信號分子交流，屬于一種物理過程。在生物膜中，細菌細胞鑲嵌在它分泌產生的胞外物質里拉近了細胞之間的交流，可以分享營養物質、酶類以及二次代謝產物[15]。空腸彎曲桿菌基因組相對比較小，基本代謝產物的生物合成能力有限，但運載系統發達，可以將其他細菌產生的二次代謝產物運輸給自己[14,16]。此外，Hilbert等[17]在大氣環境下將空腸彎曲桿菌和銅綠假單胞菌共生培養，發現空腸彎曲桿菌的生長良好，Ica等[18]也得出相同結論，并對共生形成的生物膜作用機制進行探究，發現共生生物膜的形成不僅有利于空腸彎曲桿菌利用銅綠假單胞菌的次級代謝產物，銅綠假單胞菌消耗氧氣還可以給空腸彎曲桿菌有利的微需氧環境。

2空腸彎曲桿菌生物膜的調控機理

細菌本身的附屬結構是形成生物膜的關鍵因素。比如說鞭毛、纖毛、菌柄等結構可以是生物膜形成初期粘附到介質表面有力的觸手，同時也可以消除與界面產生的靜電斥力，更好粘附。對于空腸彎曲桿菌，最重要的粘附結構便是鞭毛。對鞭毛的研究現在比較透徹，人們通過基因敲除的辦法構建鞭毛基因flab突變株，證實鞭毛基因在空腸彎曲桿菌早期粘附過程中有重要作用[10,19–20]。此外，鞭毛還是空腸彎曲桿菌與運動相關的重要器官，Martin等[21]通過比較浮游態與生物膜態蛋白表達情況，發現生物膜態與運動相關蛋白比浮游態高出很多倍，其中，這些在生物膜態時上調的運動相關蛋白主要是鞭毛基因flab和趨向性蛋白CheA等。運動與生物膜形成相關，Reuter等[10]發現運動能力缺失的菌株生物膜量減少。

生物膜的構成主要是胞外多糖、蛋白質、核酸以及小分子物質等。這些控制胞外分泌物的基因均有可能影響生物膜的形成。比如Asakura等[11]通過敲除與粘附相關胞外蛋白PEB4基因，發現其對真核生物的侵襲定植能力和生物膜形成能力均下降。Helen等[22]通過比較eDNA酶添加與未添加兩種狀況下成膜量，證明eDNA是空腸彎曲桿菌生物膜的重要組成成分。一類起應激調節作用的基因也發揮作用，特別是對氧的應激反應。比如空腸彎曲桿菌調節對氧氣適應力相關的烷基氫過氧化物還原酶基因ahpC(alkylhydroperoxidereductase)主要是清除細胞內活性氧和脂質氫過氧化物，它的缺失表達可以使細菌運動能力略有降低，理論上運動能力降低會使生物膜減少，但事實上生物膜依然顯著增加，說明不是運動導致生物膜的變化，主要是ahpC基因缺失的影響，同時Oh等[23]通過實驗還證明了在ahpC過表達時會降低生物膜的形成。此外，超氧化物歧化酶基因sodB和sodC，還有介導氧氣應激反應的CrSA神經酰胺合成酶(ceramidesynthase)基因的表達可以增強空腸彎曲桿菌對氧氣壓力的耐受性，并使運動能力、粘附和定植腸上皮細胞的能力增加，促進生物膜的形成等[23–24]。這類影響生物膜形成的相關基因表達是由應激反應調節系統有序調控作用的結果。細菌中最常見的調節系統叫雙組分調節系統(TCRSs)，它通過傳感器組氨酸激酶(SK)和與其同源的胞質DNA結合反應調節蛋白(RR)之間的磷酸化轉換來傳遞環境變化的信息[25]。TCRSs在許多病原菌中控制與毒力和生存密切相關的表型，而在空腸彎曲桿菌中發現CprRS(Campylobacterplanktonicgrowthregulation)雙組分調節系統，它包含一個關鍵的應激反應因子(CprR)，和對外界刺激感應的激酶CprS[26]。CprS是一種組氨酸蛋白激酶，用來感受外界環境的刺激，通過自體磷酸化來傳遞信息給胞質內的反應調節蛋白CprR，CprR的N端含有能接受磷酸基團的天冬氨酸殘基位點，相對保守，為調控序列，C端為效應區，有能與不同DNA序列特異性結合的位點。外界的刺激會首先使得CprS磷酸化，隨后，因為CprS與CprR相鄰且同源，它們共同構成一個轉錄操縱子，CprR的調控序列與磷酸化的組氨酸激酶相互作用，使得激酶上的磷酸基團轉移到天冬氨酸位點上，激活CprR的效應區，使其構象改變，產生一系列反應，調控下游膜蛋白相關基因的表達。Svensson[26]等構建△CprS突變株，發現生物膜顯著增強，因為CprS缺失導致了與其同源相鄰的CprR磷酸化程度減少，使得下游與膜蛋白相關基因表達異常。CprRSTCRSs系統主要是通過控制空腸彎曲桿菌關鍵的生物合成進程、抗逆性以及生物膜的形成來調節其生存能力和發病機制相關的表型，是空腸彎曲桿菌調控細胞膜表面相關基因表達的首要調節系統，使得這種脆弱的病原菌能夠在環境中生存下來[25]。生物膜的形成和調控是多種調控系統以及對應的大量基因協同作用的結果，目前研究得較多的調節系統還有群體感應系統。它也可以調節細菌各項生命活動，包括胞外蛋白和各種酶的合成、生物膜的生長、抗生素的生物合成、生物表面活性劑的合成、胞外多糖的合成以及革蘭氏陰性細菌的胞外毒力基因的表達等[27]，其中起作用的物質被稱為信號分子。信號分子調控機制在副溶血性弧菌上[28]研究較多，由Luxs基因產生AI-2類信號分子調控機制最為常見。Elvers等[29]證實了空腸彎曲桿菌的Luxs基因在突變菌株中不產生AI-2信號分子，而且還證明在生長的不同階段信號分子的表達情況也不一樣。

AI-2信號分子受體有兩類，在其它菌株中已被證實，一類受體感受信號分子通過雙組分信號系統，另一類受體通過內化和磷酸化AI-2信號分子，但在空腸彎曲桿菌中暫未發現有受體存在，Linda等[30]對空腸彎曲菌內的信號分子AI-2做了深入研究，通過實驗否定了內化作用的影響，并提出以后的研究應該更多的轉向雙組分信號系統的研究上來。信號分子是細胞間的一種交流方式，通過信號分子的表達，可以使細胞間的交流增多，甚至使DNA發生轉移，比如某些空腸彎曲桿菌攜帶的抗生素抗性基因會在生物膜膜內不同菌株間發生傳遞[31]，從而增強整個群體的抗生素抗性，還可以調節生物膜的形成及裂解。

3空腸彎曲桿菌生物膜形成的控制方法

3.1物理化學清洗法在食品行業中，機械沖洗是減少生物膜的重要手段，但難以解決死角殘留的問題。利用各種不同的表面活性劑和強力去污劑以及酸堿或氧化劑等，時間長了又會對食品加工機械不銹鋼的表面造成腐蝕，改變金屬表面原本光滑不易粘附的結構，造成更為嚴重的生物膜粘附，且化學物質很難穿透已經形成的生物膜到達內部殺滅細菌[32]。

3.2生物防治法生物防治包括生物酶、噬菌體等。生物酶洗滌劑被稱為是一種綠色的清洗劑，能高效去除特定的生物膜。但生物膜是由各種不同的蛋白和多糖等構成，而酶的專一性使得降解過程需要大量不同的酶類，過程復雜。噬菌體在自然界中無所不在，用噬菌體去侵染形成生物膜的細菌可行性很高，精確又無毒性[33]。但要確定生物膜形成的細菌種類相當困難，目前這種方法還并未成功運用到實際生產中。總的來說用生物防治法去除某類病原菌的生物膜過程非常復雜。

3.3天然植物提取物添加法天然植物法是指利用自然界的各種天然植物或其抽提物來抑制生物膜的形成，其好處在于綠色且可行性高。Salaheen等[34]發現黑莓和藍莓果渣可顯著抑制空腸彎曲桿菌的生長，添加在肉制品和飲用水中，既能改善風味還能殺菌，最重要的是無公害。還有很多已經被發現及證實有抑制甚至殺滅空腸彎曲桿菌功效的物質比如桔類抽提物以及卡拉膠和芥末[35–36]等。這些無毒無害的天然產物殺菌作用顯示了美好的前景，但是其抑制生物膜的功效還要進一步研究和改善。

3.4納米氧化物處理法近年來，有關納米抗菌材料的研究已經成為了熱點。Aruoja等[37]通過比較納米ZnO、CuO、TiO2的殺菌效果，發現氧化鋅效果最好。氧化鋅是一種常用的化學添加劑，廣泛地應用于塑料、油漆涂料、藥膏、食品等產品的制造中。氧化鋅能帶隙和激子束縛能較大，在自然光下就能產生電子躍遷起到殺菌效果，如果用在食品行業還可以給人體補充微量元素[39]，特別是對空腸彎曲桿菌的抑制效果非常好[37]。羥基自由基與超氧化物自由基均帶有負電荷，無法穿透生物膜殺滅細菌，但是過氧化氫可以。氧化鋅納米顆粒比表面積大，性質穩定，可以持續殺滅細菌，在以后食品加工設備上用作涂層既方便實用又可有效控制空腸彎曲桿菌及其它一些病原菌的生長。納米氧化鋅殺滅空腸彎曲桿菌的機理已有研究[39]，但對空腸彎曲桿菌的生物膜作用還未見報道。本文作者通過實驗發現納米氧化鋅對空腸彎曲桿菌的生物膜有很好抑制效果，正在研究其抑制生物膜的內在機理。納米氧化鋅顆粒因其有這些獨特的優勢，有望在未來控制食品空腸彎曲桿菌污染中進行應用。

4問題和展望

目前國內外對于空腸彎曲桿菌生物膜形成的分子機理的研究尚有待深入，與生物膜形成相關的群體感應系統信號分子的受體研究不夠清晰；另外在CprRSTCRSs系統中，由于在體外很難純化CprS，CprS是否直接導致CprR磷酸化還沒有被證實。由于生物膜的調控本身就是一個復雜的過程，今后的研究要結合各種因素，包括形成生物膜的外部條件以及內在不同的調控系統和基因進行綜合分析。

近年來，本實驗室的李輝、陳謀通[40]相繼初步摸索了阪崎腸桿菌和單增李斯特菌生物膜形成和調控機理。隨著實驗室陸續對全國范圍內食品中食源性致病菌(包括空腸彎曲桿菌)的采樣調查研究的完成和污染溯源分析，目前已建立起包括空腸彎曲桿菌在內的食源性致病菌標準菌種資源庫，保藏菌株超過16000株，下一步將對分離得到的我國代表性空腸彎曲桿菌優勢菌株進行全基因組測序，挖掘新的分子靶標，在建立快速高通量檢測技術的同時，將對其生物膜形成的信號轉導和調控機制進行進一步研究，以期為預防和控制空腸彎曲桿菌在食品中的污染提供理論依據和技術支持。

作者：吳清平 鐘顯 張菊梅 單位：廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室 廣東工業大學輕工化工學院，化學工程專業