探析食品中沙門菌檢測驗(yàn)證結(jié)果范文

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摘要:為了考察實(shí)驗(yàn)室對(duì)沙門菌的檢測能力，按照GB4789.4-2016和3M測試片兩種不同方法對(duì)能力驗(yàn)證的盲樣進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)將盲樣與標(biāo)準(zhǔn)菌株做對(duì)照。經(jīng)過預(yù)增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定，兩個(gè)盲樣均得到滿意結(jié)果。2種方法均能夠準(zhǔn)確地鑒定出沙門菌。通過這次能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室的能力得到了有效的證明。

關(guān)鍵詞:沙門菌；國家標(biāo)準(zhǔn)；3M測試片；能力驗(yàn)證；盲樣

沙門菌是最常見的食源性細(xì)菌病原體，是食物傳播病原菌中研究最多的一種病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國各類細(xì)菌性的食物中毒中，沙門菌常常位居前列。所以，沙門菌的檢測是各個(gè)國家檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)食品的必檢項(xiàng)目之一。檢測食源細(xì)菌的傳統(tǒng)方法是對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離和生化鑒定，有時(shí)還需要進(jìn)行血清學(xué)鑒定，繁瑣耗時(shí)。因此快速、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)微生物的新技術(shù)、新方法不斷出現(xiàn)，可提高食品微生物檢驗(yàn)工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。通過參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，能夠發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室存在的問題，幫助實(shí)驗(yàn)室不斷改善技術(shù)和管理水平，同時(shí)還能增加客戶對(duì)實(shí)驗(yàn)室的信任程度[1]。為了提高實(shí)驗(yàn)室的檢測能力和水平，本實(shí)驗(yàn)室參加了由原遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局組織的沙門菌檢測能力驗(yàn)證。此次能力驗(yàn)證樣品2個(gè)、標(biāo)準(zhǔn)菌株1個(gè)、樣品4個(gè)、樣品加標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌懸液2個(gè)，共9個(gè)樣品采用國標(biāo)GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)方法》[2]和3M測試片法，2種方法對(duì)測試樣品進(jìn)行檢測分析，取得滿意結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料沙門菌樣品

（凍干粉），由原遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局提供；鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）3M測試片，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；4種口味的壓縮干糧，由軍代室提供。

1.2培養(yǎng)基和試劑緩沖

蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂、沙門菌顯色培養(yǎng)基、沙門菌干制生化鑒定試劑盒，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。沙門菌屬O多價(jià)血清A-F，購于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；AV8101精密天平（美國SpiralBiotech公司）；400VW均質(zhì)器（法國Interscience公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

2樣品制備

2.1樣品原液的制備

無菌開啟西林瓶，立即加入少量（2～4mL）稀釋液（生理鹽水）進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述的無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，全過程20min內(nèi)完成[3]。

2.2菌懸液的制備

以無菌生理鹽水將鼠傷寒沙門菌制成菌懸液，于36℃±1℃，18～24h增菌培養(yǎng)后備用。

3檢驗(yàn)方法及結(jié)果

采用GB4789.4-2016和3M測試片2種方法進(jìn)行檢測。其中3M測試片只做前增菌的步驟。同時(shí)2種方法均利用標(biāo)準(zhǔn)菌株作對(duì)照。

3.1預(yù)增菌

（1）以無菌操作吸取水化后的樣品原液25mL，加入裝有225mL滅菌BPW的無菌錐形瓶，震蕩搖勻。（2）固體樣品粉碎后稱取25g，加入滅菌225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器拍打1～2min。（3）20g粉碎固體樣品和5mL菌懸液后加入滅菌225mLBPW的無菌錐形瓶，用均質(zhì)器拍打1～2min。于36℃±1℃，培養(yǎng)8～18h。

3.2增菌

取預(yù)增菌后的BPW緩沖液中分別移取1mL轉(zhuǎn)接種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18～24h；移取1mL轉(zhuǎn)接種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。用無菌吸管吸取1mL能力驗(yàn)證樣品、樣液和樣品加菌懸液的勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右；同時(shí)做菌株的勻液。于36℃±1℃，培養(yǎng)15～24h。結(jié)果：沙門菌在3M測試片上的結(jié)果應(yīng)為綠色菌落。（1）菌株在3M測試片上的結(jié)果為綠色菌落。（2）能力驗(yàn)證樣品1在3M測試片上的結(jié)果為黃色菌落。（3）能力驗(yàn)證樣品2在3M測試片上的結(jié)果為綠色菌落。（4）樣品1在3M測試片上的結(jié)果為黃色菌落。（5）樣品2在3M測試片上的結(jié)果為黃色菌落。（6）樣品3在3M測試片上的結(jié)果為黃色菌落。（7）樣品4在3M測試片上的結(jié)果為黃色菌落。（8）樣品加菌懸液1在3M測試片上的結(jié)果為綠色菌落。（9）樣品加菌懸液2在3M測試片上的結(jié)果為綠色菌落。

3.3分離

取增菌后的沙門菌增菌液分別接種在沙門菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板于36℃±1℃，培養(yǎng)18～24h。BS瓊脂平板上，于36℃±1℃，培養(yǎng)40～48h。觀察各個(gè)平板上生長的菌落形態(tài)，詳見表1。通過觀察可以確定沙門菌顯色培養(yǎng)基生長的白色和藍(lán)綠色菌落、BS瓊脂平板上白色的菌落為非典型菌落，不符合標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)可以排除。沙門菌顯色培養(yǎng)基上的紫色菌落為A菌，XLD瓊脂平板上的能力驗(yàn)證樣品1上和樣品1～4上為黃色菌落為B菌，黑色菌為C菌，能力驗(yàn)證樣品2上的菌落形態(tài)是黑色有光澤和黃色為D和E菌，BS瓊脂上灰黑色無光澤為F菌，灰綠色帶有黑心為G菌，黑色有金屬光澤為H菌。一共8種菌落為可疑菌，需進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定。

3.4生化鑒定套裝試驗(yàn)結(jié)果

（1）分別從沙門菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A到H共8種菌落及標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基上，于36℃±1℃，培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，詳見表2。通過在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基生化試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的B、C、F3種菌落生化反應(yīng)均不符合沙門菌的生化特征，標(biāo)準(zhǔn)菌株符合沙門菌的生化特性。（2）生化鑒定套裝試驗(yàn)：分別從沙門菌顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A、D、E、G、H共5種分別接種到沙門菌干制生化鑒定試劑套裝中的試劑中，于36℃±1℃，培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果詳見表3。通過生化試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的A、D、E、G、H5種菌落生化反應(yīng)均符合沙門菌的生化特征，標(biāo)準(zhǔn)菌株符合沙門菌的生化特性。

3.5血清學(xué)鑒定先檢查待測菌有無自凝現(xiàn)象。

經(jīng)檢查兩種可疑菌均未發(fā)生自凝的現(xiàn)象。在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區(qū)域，挑取一環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在右邊區(qū)域加1滴沙門菌屬O多價(jià)血清A-F，在左邊區(qū)域加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無菌的接種環(huán)將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液[2]。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min，并對(duì)著黑色背景進(jìn)行觀察，可疑菌A、D、E、G、H均發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陽性，B、C、F可疑菌均未發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陰性。標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生凝集反應(yīng)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為陽性。

4結(jié)論

利用2種方法檢測能力驗(yàn)證樣品1均未檢出沙門菌，能力樣品2均檢出沙門菌，結(jié)果為滿意。樣品1～4未檢出沙門菌、菌懸液加樣品1和樣品2有效的檢出沙門菌。3M測試片的方法無需特定的儀器設(shè)備，且操作簡單、快速出結(jié)果、靈敏度高、易于判斷；該方法已獲得AOAC官方方法認(rèn)證，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合應(yīng)用于廣大食品企業(yè)和政府實(shí)驗(yàn)室沙門菌的檢測[4]。國標(biāo)法是經(jīng)典的檢測方法，但檢測周期長，過程復(fù)雜[5]。3M測試片方法檢測能夠快速準(zhǔn)確的檢測出結(jié)果。2種方法結(jié)合，綜合判斷，可確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過這次能力驗(yàn)證，提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，積累經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了很多不足：（1）3M測試片法中由于實(shí)驗(yàn)室很少做，因?yàn)椴恢芰︱?yàn)證樣品中添加的沙門菌的濃度，直接使用前增菌液，導(dǎo)致測試片上沒有單個(gè)菌落生長，最好使用增菌后的的液體。或者使用3M測試片法測定沙門菌配套的試劑。（2）沙門菌分離純化可疑菌的時(shí)候，需要多次純化，本次實(shí)驗(yàn)只挑取了選擇瓊脂上的可疑菌落，以后實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)可疑菌的時(shí)候應(yīng)在營養(yǎng)瓊脂純化后再進(jìn)行生化試驗(yàn)。（3）血清學(xué)鑒定的時(shí)候兩種診斷血清都應(yīng)該做，然而實(shí)驗(yàn)室只做了沙門菌屬O多價(jià)的，盲樣未凝集故實(shí)驗(yàn)室沒做抗原H的鑒定，在以后的試驗(yàn)過程中如果O多價(jià)凝集后必須再做抗原H的鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1]李晶，黃鴻新，鄭燕.能力驗(yàn)證對(duì)提升實(shí)驗(yàn)室檢測能力的作用[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17（2）：121-122.

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[3]陳蕊君，馬秀玲，徐騰月.食品中志賀氏菌的檢測能力驗(yàn)證結(jié)果分析[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，33（4）：372-374.

[4]陳露露，方柯.3MPetrifilmTM沙門氏菌快速測試片法效果評(píng)價(jià)[J].食品工業(yè)，2016，37（3）：118-120.

[5]張艷超，史永剛，衛(wèi)佳歡，等.3種方法檢測食品中沙門菌能力驗(yàn)證結(jié)果分析.[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2016，26（3）：14-17.

作者：徐騰月 任霞 單位：中國人民解放軍食品檢測試驗(yàn)中心