琥珀酸木糖發酵的研究范文

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《生物技術雜志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗材料野生型大腸桿菌(E.coli)MG1655、K－12、W3110、C－1、2507、5365、W1485由作者實驗室保存;大腸桿菌MLB(MG1655△ldhA、△pflB)與CLB(C－1△ldhA、△pflB)由本研究構建。質粒pKD4、pKD46、pCP20為作者實驗室保存。

1.1.2試劑膠回收試劑盒、DN段純化試劑盒、質粒DNA小量純化試劑盒、Taq酶由上海生工生物工程技術服務有限公司提供;DNAmarker、dNTP、λ－EcoT14Marker、DL2000DNAMark-er、PCRbuffer、DpNⅠ由Takara公司提供。NH4Cl(Ammoniumchloride)、KH2PO4(Potassiumdihydro-genphosphate)、CaCl2(Calciumchlorideanhydrous)、NaOH、H2SO4、Tris－HCl、NaCl(Sodiumchloride)，分析純AR，上海凌峰化學試劑有限公司;MgSO4•H2O(Magnesiumsulfate)，分析純AR，上海美興化工有限公司;瓊脂粉(Agar－agarpower)，生化試劑BR，國藥集團化學試劑有限公司;Tryptone、YeastEx-tract，OxoidLTD;氨芐青霉素(AmpicilinSodiumSalt)、卡那霉素(KanamycinSulfate)，分析純AR，Genebase。

1.1.3儀器設備分析天平，上海奧豪斯公司;不銹鋼手提式滅菌鍋DSX－280B，上海申安醫療器械廠;DHG－9140A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠;Eppendorf高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司;精密數顯酸度計，上海天達儀器有限公司;SW－CJ－1FD單人單面潔凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司;BIOERPCR儀，杭州博日科技有限公司;DY－A電泳儀，上海西巴斯生物技術開發有限公司;瓊脂糖水平電泳槽YR－158，上海伊瑞生物科技儀器有限公司;高速離心機，ThermoSCIENTIFIC;高壓蒸汽滅菌器，TOMYSX－700;恒溫搖床，江蘇太倉市實驗設備廠;酸度計，上海天達儀器有限公司;ZC－10智能型恒溫水槽，寧波天恒儀器廠;液相色譜儀，日本島津公司。1.1.4培養基①LB培養基(/L):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。②固體LB培養基:LB培養基中加入15g/L瓊脂粉。③種子培養基(/L):木糖5g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，氯化銨1g，1%維生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。④搖瓶發酵培養基(/L):木糖15g，NaHCO315g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，1%維生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。⑤抗生素母液的配制:用分析天平分別稱取0.5000g卡那霉素、0.5000g氨芐青霉素，分別溶于10ml超純水，潔凈工作臺下用微孔過濾膜(0.22μm)過濾除菌，－20℃冰箱保存備用。使用時，培養基中氨芐青霉素的終濃度為100μg/ml，卡那霉素的終濃度為50μg/ml。

1.2方法

1.2.1野生型大腸桿菌搖瓶發酵①搖瓶發酵:采用兩階段法發酵，即先好養階段培養，主要用于收集菌體，然后轉入厭氧，開始發酵生產產物。實驗方法:將1mL冷凍甘油管保存的菌液接入到已滅菌的裝有30mLLB培養基的250mL三角瓶中，37℃、220r/min培養9h;取LB中活化的種子培養液2mL轉接于裝有100mL二級種子培養基中的500mL搖瓶中，于37℃、220r/min培養約10h，此時好養階段結束;然后8000r/min、4℃離心5min，收集菌體并重懸于100ml發酵培養基中，培養基分裝在兩個50ml藍口瓶中，裝液量為40ml，藍口瓶上方用CO2氣袋通過滅菌的空氣過濾器通氣約30s，180r/min、37℃下厭氧發酵10h。②發酵產物的檢測:取1ml發酵液，離心后，過濾上清液用于HPLC測定。進樣量60μl，色譜柱Bio－RadAminexHPX－87H，柱溫為65℃，流動相為5mmol/L的稀硫酸，流速設定為0.6ml/min。

1.2.2利用Red重組法構建大腸桿菌MLB與CLB實驗步驟:引物設計→PCR、電泳、回收→酶切→電泳、再回收→制備感受態轉入質粒pKD46→回收片段與感受態混合電轉→涂卡那霉素平板→挑取菌落鑒定→pKD46質粒丟失→制備感受態轉入質粒pCP20→抗性片段的消除、鑒定。實驗中所有引物由軟件PrimerPremier5設計，由上海生工有限公司合成。基因敲除所用的引物見表1，5’端50bp堿基序列為靶基因兩側的同源臂，表中斜體部分，電擊時，PCR擴增出的線性片段與靶基因的同源區域能夠發生同源重組置換，達到敲除目的，用鑒定引物進行PCR驗證，并進一步測序確認。然后導入質粒pcP20消除抗生素片段的抗性，從而敲除ldhA基因，構建菌株ML。以ML為出發菌株，重復上述方法敲除pflB，從而構建MLB。CLB菌株的構建方法類似。

1.2.3兩階段搖瓶發酵實驗方法同1.2.1發酵產物的檢測:檢測方法見1.2.1。

2結果與分析

2.1野生菌搖瓶發酵本研究首先對不同野生型大腸桿菌的木糖利用和產酸情況進行了比較，結果見表2。在以木糖為碳源兩階段搖瓶發酵中，不同的菌株表現出了顯著的差異，這幾組數據統計學結果顯示其p值為0.0045＜0.01，表明其統計學上差異極其明顯。從表2中可以看出在這些野生型菌株中，琥珀酸產量和得率最高的是大腸桿菌B系的5365菌株，其產量為6.41g/L，得率為0.53g/g，其次是C－1菌株，產量為5.58g/L，得率為0.47g/g，而產量最低的是W3110，其產量只有4.23g/L，而得率僅有0.34g/g。同時，可以看出野生菌株的副產物占了較大比例，其中乳酸的積累是最多的。乳酸的形成對琥珀酸影響最大，一方面是碳源的分流，更重要的是乳酸途徑會競爭NADH，而降低琥珀酸的產量。乙酸的積累雖然較乳酸相對少些，但仍然對碳源分流造成了較大影響。

2.2副產物途徑敲除根據野生菌株的實驗結果，選擇W1485、MG1655、C－1三株菌進行副產物途徑敲除的探索，其琥珀酸的產量高低順序都為C－1﹥MG1655﹥W1485，C－1菌株的副產物相對較少，琥珀酸得率較W1485高出了17.5%。副產物途徑敲出的構建，主要是進行乳酸脫氫酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的敲除。其中NZN111是W1485的雙缺失菌株，而MLB和CLB分別在本研究中由MG1655和C－1構建的雙缺失菌株。圖1和2是雙缺失菌株構建完成后，進行PCR證的結果。鑒定引物分別以陽性克隆、野生型為模板，陽性克隆中ldhA基因已被卡那霉素片段替換，ldhA基因大小為990bp，pflB基因大小為2183bp，卡那霉素片段大小為1438bp，從圖1可以看出對照組擴增出片段大小與ldhA大小接近，陽性克隆大小與卡那霉素片段接近，從圖2可以看出對照組擴增出片段大小與pflB大小接近，陽性克隆大小與卡那霉素片段接近，初步鑒定基因敲除成功，進一步測序結果顯示，基因敲除成功。

2.3NZN111、MLB、CLB的搖瓶發酵大腸桿菌雙基因缺失菌株NZN111、MLB、CLB菌株的搖瓶發酵木糖結果如表3。從表3可以看出，菌株的ldhA和pflB雙缺失后，對于提高菌株的產酸得率非常有效，MLB與NZN111基于木糖產琥珀酸的得率基本一致，分別為0.89g/g與0.90g/g，而CLB略高為0.92g/g，三個菌株的產物和副產物的產量比較接近。與野生型菌株比較，木糖的消耗沒有減少，統計學結果顯示這三組數據p值為0.145＞0.05，表明這三株雙缺失菌株產琥珀酸顯著性差異不明顯，與野生型菌株相比，雙缺失后菌株之間的產琥珀酸能力的差異縮小。但與野生型菌株相比琥珀酸的產量和得率都有顯著提高，將表3中MLB、CLB菌株與表2中MG1655、C－1菌株琥珀酸產量進行統計學分析可得其p值分別為0.00069＜0.001、0.00044＜0.001，這表明雙缺失菌株與其對應的野生菌產琥珀酸的量在統計學上的差異極其顯著。MG1655菌株琥珀酸對木糖得率為0.40±0.01g/g，敲除基因ldhA與pflB后，得率提高到0.89±0.02g/g;而C－1菌株琥珀酸對木糖得率為0.47±0.01g/g，敲除基因ldhA與pflB后，得率提高到0.90±0.02g/g。CLB菌株的乙酸生成變化不大，而MLB和NZN111的乙酸生成明顯減少，而乳酸基本檢測不到，因此乳酸脫氫酶的敲除對副產物乳酸的合成能夠有效的控制，并且考慮到乳酸合成途徑中NADH的需求，該途徑的活性確實造成了琥珀酸NADH途徑流量的競爭。丙酮酸甲酸裂解酶能夠催化丙酮酸裂解為甲酸，甲酸在甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase)催化下進一步生成H2和CO2，該支路也為琥珀酸合成的競爭途徑，pflB基因的缺失可以減少副產物的比例，提高目的產物的產量和得率。特別是乳酸途徑、乙醇途徑和琥珀酸途徑競爭NADH，因此pflB與ldhA的敲除能顯著減少木糖代謝途徑中的副產物的產量，有利于琥珀酸的高產。

3討論

本研究通過比較野生型大腸桿菌利用木糖兩階段發酵生產琥珀酸，發現產琥珀酸得率最高的是大腸桿菌B系的5365菌株，其產量為6.41g/L，得率為0.53g/g，其次是C－1菌株，產量為5.58g/L，得率為0.47g/g，而產量最低的是W3110，其產量只有4.23g/L，得率僅有0.34g/g，為選取優良野生菌發酵木糖產琥珀酸提供了一定的依據。并利用Red重組法敲除野生菌的ldhA與pflB，構建了兩株雙基因缺失型菌株，發酵結果表明琥珀酸對木糖的得率顯著提高，達到0.90g/g，與王健等人研究結論相比，得率提高了50%。目前，以木糖為碳源發酵產琥珀酸的研究不多，特別是厭氧發酵的研究較少，當前熱點主要集中在利用葡萄糖發酵產琥珀酸。然而，木糖是木質纖維素水解液的重要組分，是除葡萄糖以外第二豐富的單糖，利用木糖產琥珀酸同樣具有廣闊的前景。本研究結果表明利用木糖為碳源發酵產琥珀酸雖然得率較高(達到0.92g/g)，然而產量仍然較低，如何在發酵罐中通過發酵優化來提高琥珀酸的產量也是下一步研究中亟待解決的問題。

作者：唐緒位李運杰李志敏葉勤單位：華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室