不同溫度培養(yǎng)對香菇漆酶活性的影響范文

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摘要:以香菇新808為材料，研究不同溫度培養(yǎng)下漆酶活性及其基因表達(dá)調(diào)控特征．通過平板培養(yǎng)法測定4種溫度(20℃、25℃、28℃和30℃)對香菇菌絲圈及氧化圈的影響，通過液體發(fā)酵測定漆酶活性，并采用qPCR技術(shù)檢測漆酶同工酶基因的相對表達(dá)量．結(jié)果表明:不同溫度條件下，漆酶的活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在明顯差異．25℃培養(yǎng)條件下香菇菌絲圈及氧化圈最大，漆酶活性最強(114．11U/mL);而30℃時的菌絲圈和氧化圈最小，漆酶活性低(47．52U/mL)．不同溫度培養(yǎng)下漆酶同工酶基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，以25℃為對照組，20℃培養(yǎng)條件下9個漆酶基因(Llac1-3、Llac5和Llac7-11)表達(dá)量上調(diào)，28℃處理下除Llac5和Llac7基因以外，其余8個漆酶基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，而30℃處理組6個漆酶基因(Llac1-2、Llac4、Llac7-8和Llac10)表達(dá)量下調(diào)．表明20℃處理下有助于漆酶基因的表達(dá)，而30℃處理下則抑制了其同工酶基因的表達(dá)．

關(guān)鍵詞:香菇;漆酶基因家族;相對表達(dá)量;溫度

1引言

木質(zhì)素作為儲量巨大的潛在綠色資源，在自然界中廣泛存在，近年來對其綜合利用越發(fā)受到重視，木質(zhì)素降解不僅能夠減少環(huán)境污染也能促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的利用效率［1］．因此木質(zhì)素降解酶在土壤修復(fù)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有巨大的研究價值和應(yīng)用潛力［2］．漆酶作為主要的木質(zhì)素降解酶，通過Cu2+催化氧化酚類化合物，使得酚類及木質(zhì)素化合物裂解形成自由基，進(jìn)一步解聚，達(dá)到降解木質(zhì)素的目的［3］．漆酶具有重要的生物學(xué)功能和應(yīng)用價值，近年來一直是環(huán)境保護(hù)、生物檢測、造紙工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域中的研究焦點．對木質(zhì)素的降解主要靠微生物來完成，白腐真菌作為最主要的木質(zhì)素降解微生物，主要依靠其分泌木質(zhì)素降解酶對其進(jìn)行徹底的降解［4，5］．真菌漆酶的功能具有多樣性，并且具有較高的氧化還原電勢，在工業(yè)領(lǐng)域中有巨大的應(yīng)用潛力［6］．香菇(Lentinusedodes)隸屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomy-cetes)，傘菇目(Agaricaceae)，蘑菇科(Lepiotaceae)，香菇屬(Lentinus)，是一種高蛋白、低脂肪、富含多糖、氨基酸和多種維生素的菌類食物，具有提高機體免疫力、降低血液中的膽固醇等多種療效．同時香菇作為重要的木腐菌，具有較大的潛在漆酶產(chǎn)生能力，香菇菌絲生長時期，漆酶分泌旺盛，破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使得更多的木質(zhì)素纖維素暴露出來，為香菇菌絲體生長提供更多的碳源［7］．香菇新808作為大眾主推秋栽品種，推廣栽培面積大，子實體肉厚結(jié)實，菇大柄短，菇質(zhì)較優(yōu)且產(chǎn)量高，深受廣大菇農(nóng)的喜愛．該菌株生長速度快，菌齡90～120d，菌絲生長溫度范圍為5～33℃，出菇溫度為12～28℃，最適溫度為20～28℃．漆酶在食用菌生長發(fā)育過程中起重要作用，除了參與培養(yǎng)料中木質(zhì)素的降解，還調(diào)控原基分化、子實體的形態(tài)建成和發(fā)育［8］．孫淑靜等人研究6種不同食用菌品種產(chǎn)漆酶規(guī)律，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)漆酶能力強的菌株其菌絲生長速度較快［9］．隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，香菇全基因組測序的完成［10］，包括漆酶在內(nèi)的14個銅氧化物酶編碼基因被發(fā)現(xiàn)，研究者們著手從分子水平揭示香菇漆酶基因調(diào)控的分子機制．真菌漆酶的表達(dá)受不同外界條件和因素的影響，影響漆酶合成和同工酶基因表達(dá)的主要因素有培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基中的碳源、氮源、金屬離子等［11］．營養(yǎng)物質(zhì)、不同誘導(dǎo)劑對香菇漆酶的影響已經(jīng)得到較深入的研究［12］．溫度作為外界環(huán)境中的一個重要因子，可誘導(dǎo)或抑制食用菌生長發(fā)育等生命活動．郭勇等人研究表明溫度影響食用菌的菌落及菌絲形態(tài)，適宜溫度條件下，菌絲快速生長，長勢好［13］．溫度同樣影響靈芝出芝過程中糖含量與木質(zhì)素酶系、纖維素酶系等活性［14］．香菇屬于變溫結(jié)實食用菌，在香菇栽培過程中溫度起到至關(guān)重要的作用．本試驗通過研究不同溫度培養(yǎng)條件下漆酶活性及其同工酶基因的相對表達(dá)量，分析不同溫度對香菇菌絲漆酶活性及其同工酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期為優(yōu)化香菇栽培、漆酶資源的開發(fā)利用和進(jìn)一步明晰漆酶基因的分子調(diào)控機制提供理論參考．

2材料與方法

2．1材料菌種:以中溫偏高型，椴木和袋栽兩用香菇品種新808為材料．本試驗所用菌株從郫縣香菇種植基地采集，挑選菇大圓整、品質(zhì)好的子實體，通過組織分離后不斷純化得到的香菇菌種，由本實驗室保存．PDA培養(yǎng)基配方:20%土豆、20%瓊脂、2%葡萄糖、加水補足，121℃滅菌30min．通過加入4‰愈創(chuàng)木酚測定漆酶氧化圈．PDB培養(yǎng)基配方:20%土豆、2%葡萄糖，加水補足，121℃滅菌30min．

2．2方法2．2．1培養(yǎng)條件及菌絲和氧化帶長度的測定用打孔器取1塊4×4cm的新鮮固體培養(yǎng)物，接種于PDA平板中央，分別于20℃、25℃、28℃和30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)．每天測量菌絲圈和氧化圈半徑直至長滿整個培養(yǎng)皿，每個處理設(shè)置3個重復(fù)．對于液體培養(yǎng)，取3塊4×4cm左右的新鮮固體培養(yǎng)物，接種于50mLPDB液體培養(yǎng)基中，分別于20℃、25℃、28℃和30℃培養(yǎng)30d．2．2．2漆酶活性測定分別第15和30d取樣測定發(fā)酵液中的漆酶活性，每個處理重復(fù)3個．漆酶活性測定參考肖楚等人的方法進(jìn)行［15］．發(fā)酵液4℃離心(12000r/min)10min，上清液即為粗酶液．酶活反應(yīng)體系為3mL，其中含2．7mL0．1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4．5)，0．1mL粗酶液和0．2mL的0．5mmol/LABTS溶液．30℃反應(yīng)3min，測定420nm處OD變化值．30℃每分鐘氧化lμmolABTS所需的酶量為一個酶活力單位(U)．以煮沸滅活粗酶液為對照，每個樣品重復(fù)3次．2．2．3總RNA提取及基因相對表達(dá)量收集不同溫度處理下生長30d的香菇菌絲，液氮研磨，采用Trizol法提取RNA［16，17］，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照FastKountRTKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟操作合成cDNA．qRT-PCR在Bio-rad公司的iQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行，基因的定量分析采取SYBRgreen法．qRT-PCR反應(yīng)體系為(20μL):GreenMasterMix(Vazyme)10μL、Forward和Reverse引物各100nM、RoxReferenceDye10．4μL、模板cDNA10ng，加入ddH2O補充至20μL．反應(yīng)程序為:95℃5min，95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)．通過溶解曲線分析引物的特異性，使用香菇18S基因作為內(nèi)參基因，漆酶基因引物參照秦澎［18］等人設(shè)計的10個香菇漆酶同工酶基因引物．漆酶基因的相對表達(dá)量結(jié)果采用2^－△△Ct法計算，其中ΔCt是待測基因與香菇18S基因Ct值的差異，ΔΔCt是樣品ΔCt值減去對照組ΔCt值，同時對所得結(jié)果取相反數(shù)，最后對－ΔΔCt進(jìn)行2的冪運算，每個處理重復(fù)3次．2．2．4數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)值計算，SPSS進(jìn)行統(tǒng)計分析．

3結(jié)果與分析

3．1溫度對香菇菌絲生長的影響將接種后的香菇菌餅放置不同的溫度下培養(yǎng)，直至菌絲長滿整個平板，不同溫度處理下菌絲生長情況存在明顯的差異(表2、圖1)．接種2d后，25℃培養(yǎng)條件下的菌絲率先萌發(fā)，前期菌絲生長緩慢，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲進(jìn)一步快速生長直至長滿整個平板．四種培養(yǎng)溫度下菌絲長滿的時間分別為18d(20℃)、15d(25℃)、17d(28℃)和20d(30℃)，香菇菌絲平均生長速度為0．23cm/d(20℃)，0．28cm/d(25℃)，0．25cm/d(28℃)和0．21cm/d(30℃)．菌絲圈大小測定結(jié)果顯示，25℃培養(yǎng)條件下，香菇菌絲生長速度最快，其次是28℃，而30℃培養(yǎng)條件下，香菇菌絲生長最慢.

3．2溫度對香菇氧化圈大小的影響在PDA培養(yǎng)基中加入愈創(chuàng)木酚，將接種后的培養(yǎng)皿放置不同的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，香菇菌絲周圍形成棕褐色輪環(huán)，隨著時間的延長，香菇菌絲產(chǎn)生的氧化圈大小逐漸增大．25℃培養(yǎng)條件下，氧化圈顏色較深，而30℃培養(yǎng)條件下，氧化圈顏色較淺．平板測定不同溫度對氧化圈的形成產(chǎn)生了不同的影響(表3)，不同溫度培養(yǎng)條件下氧化圈遍布整個平板時間分別為16d(20℃)、12d(25℃)、15d(28℃)和18d(30℃)．如圖1所示，不同溫度培養(yǎng)條件下，氧化圈形成平均速度存在明顯的差異，25℃培養(yǎng)條件下，氧化圈的形成速度最快，而30℃培養(yǎng)條件下，氧化圈的形成速度最慢.

3．3溫度對漆酶活性的影響將活化的香菇新808菌餅接種于PDB液體培養(yǎng)基，分別置于20℃、25℃、28℃和30℃條件下進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)．結(jié)果如圖2所示，不同溫度培養(yǎng)15d和30d后，香菇漆酶活性存在明顯的差異．培養(yǎng)15d后，香菇漆酶活性明顯低于培養(yǎng)30d的漆酶活性．在培養(yǎng)30d漆酶活性中，25℃發(fā)酵條件下漆酶活性最高，為123．51U/mL，其次為20℃(114．11U/mL)．30℃發(fā)酵條件下，漆酶活性最低，其酶活為25℃漆酶活性的0．38倍．由此可以看出，20℃和25℃發(fā)酵條件下有助于提高香菇漆酶活性，而30℃發(fā)酵條件下抑制了漆酶活性．

3．4溫度對漆酶表達(dá)量的影響為了進(jìn)一步了解不同溫度培養(yǎng)條件下，香菇漆酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)特征，采用實時熒光定量PCR分析了培養(yǎng)30d樣品中10個漆酶同工酶基因的相對表達(dá)量．如圖3所示，不同溫度培養(yǎng)下香菇漆酶同工酶基因出現(xiàn)差異性表達(dá)．以食用菌菌絲常規(guī)培養(yǎng)溫度25℃處理組為對照組，20℃培養(yǎng)條件下，除Llac4基因以外，其余9個漆酶基因的表達(dá)量均發(fā)生上調(diào)．其中Llac2基因較對照組略微上調(diào)1．12倍，其余8個漆酶基因(Llac1、Llac3、Llac5和Llac7-11)表達(dá)量明顯上調(diào)，Llac5上調(diào)幅度最大，為對照組的6．65倍．這表明20℃處理下對香菇漆酶基因的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用．28℃培養(yǎng)條件下，除Llac5和Llac7基因以外，其余8個漆酶基因表達(dá)量均明顯上調(diào)．其中，Llac9上調(diào)幅度最大，其相對表達(dá)量是對照組的5．12倍．30℃液體發(fā)酵條件對香菇菌絲漆酶基因的表達(dá)有明顯的抑制作用，有6個漆酶基因(Llac1-2、Llac4、Llac7-8和Llac10)表達(dá)量明顯下調(diào)，其中Llac7下調(diào)幅度最為明顯，較對照下調(diào)43．02倍．

4討論

漆酶的合成和分泌一般發(fā)生在菌絲生長的次級代謝階段，受多種外界因素影響，具有多種應(yīng)用價值．香菇屬于變溫結(jié)實食用菌，溫度是制約香菇生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，研究不同溫度培養(yǎng)條件下漆酶活性及其基因表達(dá)調(diào)控特征對于優(yōu)化香菇栽培、揭示香菇的漆酶分子調(diào)控表達(dá)機制具有重要意義．黃書文等人研究不同培養(yǎng)溫度(22℃、25℃和28℃)對香菇生殖生長的影響，結(jié)果表明菌絲最適培養(yǎng)溫度為25℃［19］．在本研究中，25℃培養(yǎng)條件下同樣促進(jìn)了菌絲體的生長，而30℃培養(yǎng)條件下抑制生長，隨著溫度的增加，抑制作用也不斷加強．這與栽培過程中香菇新808菌絲生長的最適溫度為25℃的結(jié)果一致，表明此溫度可能促進(jìn)了菌絲體內(nèi)某些相關(guān)代謝酶的活性或加速了某些生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)了菌絲的生長．劉尚旭［20］等人對糙皮側(cè)耳菌木質(zhì)素降解酶進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)菌絲生長與氧化圈有一定的聯(lián)系．本研究中，溫度對氧化圈的影響趨勢與菌絲生長一致，即菌絲生長良好，氧化圈也較大．25℃培養(yǎng)條件下，菌絲生長最快，氧化圈最大;其次是28℃處理組，而30℃處理組，其菌絲生長最慢，氧化圈最小．程科［21］研究溫度對白腐菌C．cinerea漆酶穩(wěn)定性的影響，20℃條件下漆酶穩(wěn)定性最高，隨著溫度的升高，漆酶的相對酶活有所下降．本研究香菇漆酶活性測定結(jié)果顯示，20℃和25℃培養(yǎng)條件下，其發(fā)酵液漆酶活性較高，而30℃培養(yǎng)條件下，漆酶活性較低．漆酶活性的高低與菌絲生長趨勢一致，表明高的漆酶活性，可以更好地分解基質(zhì)，促進(jìn)菌絲體的生長．萬云洋［22］等從漆樹漆液中分離提純得到兩種漆酶的同工酶，兩種同工酶均是低溫酶，其最適溫度分別為20℃和13℃．這表明在20℃左右的溫度條件下，促進(jìn)了漆酶活性的表達(dá)，有助于提高漆酶活性．不同溫度處理間漆酶活性測定結(jié)果與氧化圈測定結(jié)果表現(xiàn)不一致，這可能是由于氧化圈的形成除了有漆酶對愈創(chuàng)木酚的氧化作用，還有其它氧化酶(木質(zhì)素過氧化物酶)氧化愈創(chuàng)木酚．不同漆酶基因的表達(dá)受多方面因素的影響，如營養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)物等．沈柯宇［23］等研究重金屬對靈芝漆酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，結(jié)果表明4種重金屬(Pb2+、Cd2+、Cu2+和Fe2+)離子脅迫下，15種靈芝漆酶基因出現(xiàn)差異性表達(dá)．對于香菇而言，在香菇的菌絲階段，漆酶基因表達(dá)量較高，進(jìn)入子實體發(fā)育階段，其漆酶基因表達(dá)量迅速下降［24］，說明漆酶基因在香菇營養(yǎng)生長階段發(fā)揮重要作用．這些研究結(jié)果表明漆酶基因的表達(dá)受到環(huán)境因素的影響，還參與真菌生長發(fā)育過程．本研究分析了香菇10個漆酶基因在不同溫度培養(yǎng)條件下(20℃、25℃、28℃和30℃)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，初步揭示環(huán)境因子(溫度)對香菇漆酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響．結(jié)果顯示在20℃培養(yǎng)條件下，大部分漆酶基因的表達(dá)量較高;而30℃培養(yǎng)條件下，漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均較低．漆酶同工酶基因?qū)@些溫度脅迫在轉(zhuǎn)錄水平上做出了響應(yīng)，表明漆酶基因可能在香菇對溫度的適應(yīng)過程中發(fā)揮作用．秦澎［18］等人分析了香菇15和香240這2株菌株漆酶同工酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，結(jié)果顯示漆酶基因在不同菌株之間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異性和特異性，其中Llac1在2株菌株中表達(dá)量均較高，而Llac8-9表達(dá)量則相對較低．本研究中，Llac1、Llac8和Llac9在4種溫度下的轉(zhuǎn)錄水平未出現(xiàn)均較高或較低的情況，表明雖然部分漆酶基因在不同菌株之間轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無明顯差異，但在同一菌株中不同處理下幾乎所有漆酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均存在差異，這也可能是由于試驗所用菌株引起的差異．漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與其酶活性之間不存在明顯的相關(guān)性，這可能是由于培養(yǎng)溫度促進(jìn)或抑制了香菇漆酶同工酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但是否增加了漆酶在蛋白水平上的表達(dá)，還需進(jìn)一步試驗驗證．不同溫度下，香菇菌絲生長情況以及漆酶活性存在較大差異，同時在轉(zhuǎn)錄水平上做出了響應(yīng)．白腐菌降解木質(zhì)素是一個十分復(fù)雜的生化過程．對木質(zhì)素的降解，一定程度上還依賴其它木質(zhì)素降解酶［7］．在后續(xù)的試驗中，將進(jìn)一步分析溫度對香菇木質(zhì)素降解酶的分子調(diào)控機理，以期為優(yōu)化香菇栽培和木質(zhì)素降解酶資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)．

作者：陳小敏 吳海冰 向泉桔 曾先富 張小平 辜運富 單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院