哺乳動物卵母細(xì)胞冷凍保存效果范文

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《基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)雜志》2015年第四期

1卵丘細(xì)胞層對冷凍保存效果的影響

與卵母細(xì)胞相連的卵丘細(xì)胞是影響玻璃化冷凍效果的另一重要因素，關(guān)于卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞冷凍效果的影響卻出現(xiàn)不同的研究結(jié)果。部分研究者猜測卵丘細(xì)胞層及其中的糖蛋白減緩了冷凍保護劑滲透速率，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冷凍保護劑分布不均，從而未能達到冷凍保護作用(Mahmoudetal.,2010)。同時前人的研究也證實，水牛卵母細(xì)胞在冷凍前去除卵丘細(xì)胞，可起到很好的冷凍效果(Gasparrinietal.,2007)。卵丘細(xì)胞的去除增加MPF的活性、加速卵母細(xì)胞過渡到中期階段以及皮質(zhì)顆粒的再分配(Zhouetal.,2010)。Bogliolo等(2007)報道，未成熟的綿羊卵母細(xì)胞玻璃化冷凍時，除去卵丘細(xì)胞層后，其存活率明顯高于帶有卵丘細(xì)胞層的卵母細(xì)胞，而進行體外成熟時發(fā)現(xiàn)兩組的紡錘體和染色體的正常分布率差異不大。但是當(dāng)裸露的卵母細(xì)胞進行冷凍后，由于受精時缺少卵丘細(xì)胞，使得胚胎發(fā)育能力下降(Zhouetal.,2010)。體外成熟前或玻璃化冷凍前，卵丘細(xì)胞層的去除將對馬(Tharasanitetal.,2009)、鼠(Suoetal.,2009)和牛(Modinaetal.,2009)成熟或未成熟卵母細(xì)胞的形態(tài)均產(chǎn)生不利影響。小鼠未成熟卵母細(xì)胞進行玻璃化冷凍時必須保存包圍在其中的致密卵丘細(xì)胞層(Purohitetal.,2012)，附有卵丘層的牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力高于裸卵細(xì)胞，馬卵母細(xì)胞體外成熟前或玻璃化冷凍前除去卵丘細(xì)胞層導(dǎo)致了減數(shù)分裂能力、紡錘體和染色質(zhì)正常率下降(Tharasanitetal.,2009)。這可能與緊湊的卵丘細(xì)胞可阻止高毒冷凍保護劑的滲透以及在卵母細(xì)胞進行解凍時防止細(xì)胞內(nèi)滲透壓的升高有關(guān)，使細(xì)胞的膨脹得以控制。

2卵母細(xì)胞發(fā)育階段對冷凍保存效果的影響

研究者進行了多次研究以確定適合卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的最佳發(fā)階段，然而得到的結(jié)果是不確定的。卵母細(xì)胞成熟階段中的GV期(Wuetal.,2013)、GVBD期(Barnesetal.,1997)和M域期(Moetal.,2014)被認(rèn)為是最有利進行玻璃化冷凍的階段。但也有一些研究與此相反，即減數(shù)分裂階段不影響冷凍保存后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力(LeGalandMassip,1999;Hurttetal.,2000)。普遍認(rèn)為，成熟的卵母細(xì)胞富含細(xì)胞器，如紡錘體和染色體，而這些細(xì)胞器對低溫極其敏感，冷凍易造成這些細(xì)胞器的損傷。GV期的卵母細(xì)胞核被膜包被，此外也無紡錘體的形成，理論上是進行冷凍的最佳時期，但是凍融后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，卵丘細(xì)胞層脫離，使得后續(xù)發(fā)育能力嚴(yán)重下降。在小鼠卵母細(xì)胞方面，Sehrleder等(1990)則發(fā)現(xiàn)了冷凍M域期的卵母細(xì)胞，凍融后細(xì)胞的形態(tài)正常率高達81%，2-細(xì)胞發(fā)育率為17%，比GV期卵母細(xì)胞具有更好的冷凍效果。此外，Mo等(2014)報道，在冷凍綿羊卵母細(xì)胞方面，與M域期卵母細(xì)胞相比，GV期卵母細(xì)胞對冷凍更為敏感。在水牛方面，Sharma和Loganathasamy(2007)報道，冷凍保存M域期卵母細(xì)胞，其后續(xù)發(fā)育潛能高于冷凍GV期的卵母細(xì)胞。凍融后發(fā)育潛能的降低主要歸因于卵母細(xì)胞自身的損傷，而受精失敗只是其中的一小部分原因。相比之下，Barnes等(1997)表明，卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂的胚泡破裂階段進行冷凍保存，解凍復(fù)蘇后進行成熟培養(yǎng)，其后續(xù)胚胎的卵裂率和囊胚率高于GV期和M域期的。他們認(rèn)為選擇中間階段的卵母細(xì)胞進行冷凍保存，可以規(guī)避一些與低溫保存相關(guān)的問題。Otoi等(1995)報道稱在慢速冷凍中成熟卵母細(xì)胞的抗凍能力比未成熟卵母細(xì)胞強，隨后在體外培養(yǎng)到達囊胚階段的概率大于卵母細(xì)胞在成熟早期階段的冷凍。然而，當(dāng)添加了蔗糖作為冷凍保護劑，未成熟的卵母細(xì)胞冷凍保存后通過體外受精，卵裂率比凍融后M域期的高。這些結(jié)果表明，不同減數(shù)分裂階段卵母細(xì)胞冷凍保存效果的差異可能來自于冷凍保護劑類型的影響。

3冷凍保護劑的類型對冷凍保存效果的影響

細(xì)胞冷凍時添加冷凍保護劑可以促進細(xì)胞脫水，避免胞內(nèi)冰晶的形成，更高程度提高卵母細(xì)胞凍融后的存活率。當(dāng)哺乳動物細(xì)胞處于普通鹽溶液進行冷凍時，細(xì)胞將不可避免的受到損壞。然而，研究者偶然發(fā)現(xiàn)，當(dāng)家禽精子處于10%甘油和白蛋白所組成的溶液時，凍融后精子仍存活，使用凍融后的精子進行人工受精，可以產(chǎn)生后代(Polge,1952;Schieweetal.,1991)，這是第一個詳細(xì)報道了哺乳動物細(xì)胞經(jīng)過冷凍保護劑的處理后，可以成功進行冷凍保存。自從首次發(fā)現(xiàn)以來，研究人員通過不斷的試驗，發(fā)現(xiàn)許多低分子量保護劑使細(xì)胞免受冷凍傷害，這些化合物統(tǒng)稱為冷凍保護劑。目前，冷凍保護劑分為兩大類：膜滲透性冷凍保護劑(乙二醇,二甲基亞砜,丙二醇)和膜非滲透性冷凍保護劑(蔗糖,聚蔗糖,葡萄糖,蛋白質(zhì)類,脂蛋白)。膜滲透性冷凍保護劑通過以下幾種機制起作用：降低溶液的冰點，防止過高的電解質(zhì)濃度對卵母細(xì)胞的傷害；與膜相互作用，冷凍時在細(xì)胞膜表面形成一層玻璃樣狀；替代細(xì)胞內(nèi)的水份，防止胞內(nèi)冰晶的形成(Polge,1952)。慢速冷凍所需要的冷凍保護劑濃度在1~1.5mol/L之間，毒性較小，但玻璃化冷凍要求較高的冷凍保護劑濃度(高達8mol/L)，而EG和DMSO因其分子量較小而常被作為滲透性保護劑(Somfaietal.,2013)。膜非滲透性冷凍保護劑通過增加溶質(zhì)的濃度產(chǎn)生跨細(xì)胞膜滲透梯度，作為細(xì)胞外液抗凍保護劑，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部。將糖類添加到玻璃化冷凍液可以提高溶液粘度，即細(xì)胞在冷凍前用含有糖類的冷凍保護液進行處理，有利于細(xì)胞內(nèi)水分的滲出，同時減少細(xì)胞在保護劑的暴露時間，降低細(xì)胞毒性(iefetal.,2005)，并且一些膜非滲透性冷的保護劑在細(xì)胞冷凍期間能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜。通過使用兩種或兩種以上不同種類的混合物或多步平衡(兩步或兩步以上)可減少溶質(zhì)損傷。目前，研究者常聯(lián)合使用兩種類型的冷凍保護劑進行卵母細(xì)胞的冷凍保存。據(jù)報道，相比于使用單一的冷凍保護劑，兩種以上的混合物冷凍保護劑更有利于卵母細(xì)胞的冷凍保存(Chianetal.,2004;Guptaetal.,2007)。二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇和甘油通過不同的組合常用于哺乳動物卵母細(xì)胞和胚胎的玻璃化冷凍中(Moussaetal.,2014)。幾項研究表明，EG是理想的冷凍保護劑，因為它滲透入膜的速度快于其它冷凍保護劑，從而降低了對細(xì)胞的毒性(Somfaietal.,2014)。在實際操作中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)物種類型，選擇最佳保護劑組合和作用濃度，將其不利影響最小化。

4冷凍保護劑的暴露時間對冷凍保存效果的影響

玻璃化冷凍所需冷凍保護劑的濃度很高，很容易對細(xì)胞產(chǎn)生毒性(Sanchez-Partidaetal.,2011)。因此，不同種類冷凍保護劑的濃度和暴露時間對凍融后卵母細(xì)胞的存活至關(guān)重要。目前有兩種方法可將這些不良影響降到最低：一是在置于低濃度的冷凍保護劑溶液平衡之前，使卵母細(xì)胞短暫接觸含有高濃度冷凍保護劑的玻璃化溶液；二是在確保冷凍保護液滲入細(xì)胞時，盡可能縮短曝露于冷凍液的時間(Konoetal.,1991;Woodetal.,1993)。暴露于冷凍保護劑的時間主要取決于它們滲透到卵母細(xì)胞或胚胎的速度，如EG由于分子量小，滲透率比甘油、DMSO和PG高。Mahmoud等(2010)報道稱將卵母細(xì)胞分別暴露于二甲亞砜、乙二醇和甘油中，隨后通過形態(tài)學(xué)檢查顯示，未成熟的水牛卵母細(xì)胞的存活率并沒有差異。在這方面，Wood等(1993)也報道了小鼠和倉鼠的卵母細(xì)胞暴露在1.5mol/LDMSO3~5min，復(fù)蘇后大部分形態(tài)恢復(fù)正常。但在這實驗中，水牛卵母細(xì)胞成熟率卻嚴(yán)重受到影響，其中在DMSO組最嚴(yán)重，其次是甘油和EG組。Martins等(2005)報道，牛未成熟的卵母細(xì)胞在40%的EG中平衡時間長達5~15min，嚴(yán)重降低了卵母細(xì)胞的成熟率。這表明在選擇不同種類的冷凍保護劑時，暴露時間是一個非常重要的參數(shù)，最佳暴露時間可降低細(xì)胞毒性以及防止胞內(nèi)冰晶的形成。

5冷凍載體的類型對冷凍保存效果的影響

1995年，Han等(1995)研究結(jié)果表明載體所盛的溶液體積與冷凍速度密切相關(guān)，減少載體所帶的液體，能提高冷凍降溫速度。體內(nèi)外生產(chǎn)的胚胎和卵母細(xì)胞進行玻璃化冷凍時使用合適的冷凍載體進行冷凍保存，能加快冷凍與解凍速率，提高冷凍保存效率。迄今為止，使用冷凍帽法(cryotop)、開放式拉長塑料塑管法(pulledstraw,OPS)、冷凍環(huán)法(cryoloop)、玻璃微細(xì)管法(glassmicropipette,GMP)、金屬表面積法(solid-surfacevitrification,SSV)等冷凍載體保存人、山羊、牛、鼠及馬的卵母細(xì)胞或胚胎時均有獲得成功的報道。近十余年來，卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍中，OPS和Cryotop方法常被廣泛使用(Jim佴nez-Trigosetal.,2013;Alietal.,2014)。在卵母細(xì)胞和胚胎的玻璃化冷凍中，合適的冷凍載體能夠使細(xì)胞快速越過危險溫區(qū)，降低冷凍損傷程度。Subramaniam等(1990)研究表明，解凍時將冷凍管在空氣停留幾秒對于防止透明帶斷裂至關(guān)重要的。但是Cetin和Bastan(2006)研究發(fā)現(xiàn)將冷凍管在空氣中停留5s，透明帶依舊有破裂的現(xiàn)象，這可能是由冷凍載體在解凍時影響到解凍速率，未能越過冰晶的臨界溫度。此外，Lim等(1991)研究觀察到卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的存活率會因為冷凍載體的不同而出現(xiàn)差異，所以推測可通過對冷凍載體進行改善而獲得更好的冷凍效果。為了提高玻璃化的冷凍與解凍速度，有必要通過選擇更合適的冷凍載體盡可能減少所帶玻璃化溶液的體積，提高冷凍保存的效果。

6結(jié)語

低溫生物學(xué)因其在胚胎生物技術(shù)和輔助生殖技術(shù)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，受到了極大的關(guān)注。目前，玻璃化冷凍技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種哺乳動物卵母細(xì)胞的冷凍保存，然而由于卵母細(xì)胞自身的特點，造成玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用存在許多問題，主要表現(xiàn)為凍融后細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和后續(xù)發(fā)育能力降低。影響卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的因素是多方面的，很難由一方面的改進而使冷凍效果發(fā)生較大的變化。近年來平衡時間的優(yōu)化、加快降溫速率和解凍程序的改善也成了研究卵母細(xì)胞冷凍的關(guān)注點，而具體的效果有待在研究中不斷的摸索。因此，在卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的改良上，還需要進行多方面的研究。

作者：王彩玲張華智王利彭三鳳周學(xué)亮陸陽清楊小淦許惠艷盧晟盛盧克煥單位：廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室 廣西高校動物繁殖與動物生物技術(shù)重點實驗室欽州市畜牧站,