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《菌物學報》2016年第四期
摘要：
銹菌種群龐大，可以引起許多重要經濟作物和林木病害，嚴重威脅全球糧食和林業生產安全。全基因組分析為銹菌基因功能研究、毒性變異研究及銹菌演化規律研究提供了重要基礎，為制定銹病有效防控策略和創制抗銹新材料提供理論依據。本文綜述了目前銹菌全基因組分析領域的進展，對銹菌的基因組結構、基因組成、基因組變異等特征進行了歸納分析，對基因組變異與其專性寄生特性的關系、基因組變異對其毒性變異的可能影響等進行了闡述。基因組學將為最終揭示銹菌生活史復雜性和毒性高度變異性的根本成因提供有力工具。
關鍵詞：
銹菌，基因組，毒性，變異，基因組測序，進化
銹菌屬于擔子菌門真菌，已發現130多屬，5000余種，是高等專性活體寄生真菌。寄主植物被銹菌侵染后，在葉片、葉鞘、莖或果實上長出大量的橙色、褐色或者紅色銹狀孢子堆，有的還可在枝干上引起腫瘤、粗皮、叢枝、曲枝等癥狀，或造成落葉、焦梢、生長不良等。嚴重時孢子堆密集成片，植株因體內水分大量蒸發而迅速枯死。銹病是世界范圍廣泛分布的農作物和森林作物重大災害性病害（Petersen1974；Aniksteretal.2004）。近一個世紀以來，銹病中最具代表性的小麥銹病頻繁爆發流行，造成包括我國在內的全球小麥主產國毀滅性損失。研究表明，銹菌的毒性變異是導致小麥品種抗病性的“喪失”，進而造成病害大規模流行的根本原因。因此，揭示銹菌毒性變異的基礎成因是解決品種抗性“喪失”，實現病害持久控制的必由之路。生物遺傳變異的重要表現是其各種途徑導致的基因組變異，包括基因組序列變異和結構變異。序列變異主要有單核苷多態性、短序列插入與缺失）、微衛星或簡單重復序列）和轉座子等類型；結構變異主要包括大片段插入與缺失、基因有/無變異和基因拷貝數變異，表現為基因組區域大范圍的插入、缺失、復制、倒置（inversion）和移位（translocation）。研究表明，植物病原菌基因組水平的各類變異可以最終導致病原菌毒性變異。因此，全基因組測序分析和比較基因組分析是揭示銹菌類真菌演化規律和毒性變異分子機制的有效途徑。近年來，基因組學的迅猛發展為最終揭示銹菌生活史復雜性和毒性高度變異性的根本成因提供了有力工具。本文綜述了目前銹菌全基因組測序分析領域的進展，對銹菌的基因組結構、基因組成、基因組變異等特征進行了歸納分析，對基因組變異與其專性寄生特性的關系、基因組變異對其毒性變異的可能影響等進行了闡述。
1銹菌的全基因組測序分析
銹菌為專性寄生、難以在人工培養基上培養、生活史具復雜多型現象和遺傳轉化困難等使得銹菌的基因組學及基因功能研究發現相對滯后。在第一個植物病原真菌——水稻大角間座殼（稻瘟菌）Magnaportheoryzae基因組草圖（Deanetal.2005）公布6年后，基于Sanger法測序的兩個銹菌—[禾柄銹菌小麥專化型和落葉松‐楊柵銹菌]全基因組測序分析發表。隨后，基于二代高通量測序技術的5個銹菌基因組草圖先后發表（表1）。在銹菌基因組測序中，用于DNA提取的菌體都是相對易于收獲的夏孢子——一種雙核的厚壁孢子。基因組DNA序列存在高度的雜合性，雜合度是人類基因組的1.6倍（Zhengetal.2013），給銹菌基因組拼接帶來嚴重障礙，作為基因組拼接完整性重要參數的CotigN50和ScalffoldN50均大大低于水稻大角間座殼等其他真菌基因組草圖。這在基于二代測序技術的銹菌基因組拼接中更為明顯，條形柄銹菌小麥專化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici‐130基因組采用全基因組鳥槍法測序拼接，ScalffoldN50甚至只達到5.2kb（表1）。條形柄銹菌小麥專化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici‐CY32基因組通過采用Fosmid‐to‐Fosmid二次拼接策略將這一參數提高到125kb（Zhengetal.2013）。在已公布的銹菌基因組中普遍包含相對較大數量的預測蛋白編碼基因，基因數量在14445個～25288個之間（表2）。對兩個小麥銹菌（Pst和Pgt）和落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）編碼蛋白基因的對比分析表明，兩種小麥銹菌的同源基因有5560個，而Pst和Mlp的同源基因只有1937個，相比于Mlp、Pst和Pgt的同源關系更近。Pst、Pgt和Mlp種特異基因數分別為4469、5827和4922個。在Pst特異性的4469個基因中，只有14.43%（1066）和3.38%（250）在GO和PAMGO數據庫中有已知功能的同源基因（Zhengetal.2013）。這表明在基因組水平上，銹菌物種之間的差異十分顯著，這或許與其生活史的復雜性及轉主侵染的適應性需求相關。
2銹菌基因組大小與銹菌演化
基因組承載著生物進化的印跡，基因組大小是物種的重要特征。基因組的大小和動態變化對物種的進化適合度、繁殖和產生多樣性的非有性機制都有直接的影響（D’hondtetal.2011）。真核生物基因組的大小變化范圍很大，真菌是真核生物中基因組相對較小的類群。利用流式細胞技術對1850種真菌基因組大小進行評估，發現所檢測真菌平均基因組大小僅為44.2Mbp，擔子菌門真菌平均基因組大小為70.4Mbp，而銹菌平均基因組大小為305.5Mbp。最近發表的鬼針草單孢銹菌基因組達到了2489Mbp，是目前已知最大的真菌基因組（Ramosetal.2015a）。銹菌和其他真菌相比明顯表現出基因組增大的進化趨向，這種擴增趨勢可能與其寄生專化性和繁殖復雜性（無性、有性及稀少有性）的進化需求有關。具有大的、可塑性強的基因組可能有利于銹菌在分支選擇（cladeselection）中避免滅絕，在與寄主共進化中以更高的頻率產生新的毒性類型偶然地擴展到新的寄主群體或新寄主。不同銹菌基因組大小差異可以達到30倍，從櫟柱銹菌梭形專化型Cronartiumquercuumf.sp.fusiforme基因組大小76.6Mbp到鬼針草單孢銹菌U.bidentis基因組大小為2489Mbp。銹菌屬內種間的基因組大小變動范圍也明顯大于其他真菌，說明基因組大小的變異可能在銹菌進化、遺傳分化和寄主專化性演化中發揮活躍的作用（Ramosetal.2015b）。從已發表的植物病原真菌基因組對比結果可以看出專性活體營養型真菌如銹菌、白粉菌等基因組明顯大于非專性活體營養、半活體營養和死體營養型真菌（圖1）。盡管目前尚不能完整解釋這一現象的成因，但通過增大基因組（轉座子作用為主要動力）可以增加遺傳多樣性，從而減少銹菌作為活體營養的專性寄生菌在群體遺傳漂移（drift）中滅絕的可能性。
3銹菌基因組的轉座子和重復序列組分
銹菌類真菌基因組大小的顯著膨脹主要是其轉座子和重復序列成分的增加造成的，其基因數量并沒有同比例顯著增加。轉座子成分的活性可能是銹菌群體遺傳和寄生專化性（毒性）保持多樣性的重要動力，這對未發現轉主寄主的不完全銹菌（無性繁殖為主）可能更為重要，它們也往往保持著較大的基因組（Ramosetal.2015b）。落葉松‐楊柵銹菌和禾柄銹菌小麥專化型全基因組序列分析結果表明，其基因組中不存在大片段的重復，但是含有大量的轉座子和重復序列，約占整個基因組的45%。比較不同營養型真菌基因組轉座子和重復序列含量發現，與非專性活體營養真菌相比，專性活體營養銹菌類基因組轉座子和重復序列含量明顯更高（圖2）。在不同銹菌基因組中，不同類型的轉座子含量存在明顯差異（圖3）。在落葉松‐楊柵銹菌基因組中，Ⅱ類末端反向重復序列（TIR，14%）轉座子的比例較Ⅰ類長末端重復序列反轉錄（LTR，8%）轉座子的比例更高。與之相反，在禾柄銹菌小麥專化型基因組中Ⅱ類（TIR）轉座子和Ⅰ類（LTR）轉座子所占基因組的比例則分別為9.8%和12.4%。在條形柄銹菌小麥專化型基因組中Ⅰ類長末端重復序列反轉錄轉座子（LTR）和Ⅱ類末端反向重復序列（TIR）轉座子含量最高，分別占基因組的27%和17%（Zhengetal.2013）。咖啡駝孢銹菌Hemileiavastatrix的Ⅰ類長末端重復序列反轉錄轉座子（LTR）最多，占總基因組大小的38.7%。同時在咖啡駝孢銹菌基因組中發現了四種新的Ⅰ類長末端重復序列反轉錄轉座子（LTR）。由于基因組中大量轉座子的存在造成基因組的重組，使得近源種間直系同源家族基因的共線性發生了很大的變化。目前轉座子含量的差異對不同銹菌基因組以及致病性的影響還有待研究。轉座子是基因組的基本組成部分，是促使基因組防御系統發展的主要推動力，并且可以多種方式對基因組的可塑性和演變作貢獻。
4銹菌基因家族擴增與丟失
基因注釋及比較基因組分析發現，在進化過程中銹菌基因家族出現大量的擴增或缺失，以及家族內基因數量的增加或減少。相比于擁有4583個基因家族的原始祖先，禾柄銹菌小麥專化型（Pgt）目前有5413個基因家族，有1241個基因家族的增加和411個基因家族的減少。而落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）分別增加了909個基因家族，減少了188個基因家族，目前擁有5304個基因家族（表2）。一些膨脹的基因家族有物種特異性，可能在進化過程中這些基因對寄主專化性起重要作用。在禾柄銹菌小麥專化型（Pgt）和落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）中，共有5045個同源基因。但是，由于擴張的轉座子對基因組大量的改組，使得同源基因的共線性很低。Duplessiseta（l2011）利用silico對Mlp和Pgt基因組分泌蛋白（SP）進行基因預測和手動注釋，分別鑒定出了1184和1106個SP，其中譜系特異性基因分別占74%和84%。Mlp和Pgt基因組SP基因家族的膨脹非常顯著，占整個擴張基因組家族的10%（表2）。對接種葉片后表達量最高的前100個基因分析發現：落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）和禾柄銹菌小麥專化型（Pgt）中分泌蛋白的數量分別占到50%和28%。在侵染的植物組織中大多數上調表達的SP基因是譜系特異性的，只有16%在兩種銹菌中有同源基因。Zhengetal.（2013）通過比較3種銹菌（Pst、Pgt、Mlp）基因組成分發現，條形柄銹菌小麥專化型特異的基因中多數已知功能的基因類型屬于轉運蛋白，激酶、碳水化合物激活酶類和分泌蛋白（SPs），其中分泌蛋白所占比例最高。表明這些分泌蛋白基因進化速率很高，保守性很低，可能在毒性變異中發揮著重要作用（圖4）。
Nemrieta（l2014）通過對4種銹菌（Pst、Pgt、Mlp、Mli）基因組候選分泌蛋白家族預測發現，編碼幾丁質酶的家族總共有61個成員，其中32個是分泌蛋白。這表明一些效應蛋白可能從一些非分泌原始祖先進化而來，從而在真菌細胞壁以外的寄主細胞壁或者在寄主細胞內部執行相似的生物學功能。對已知的亞麻柵銹菌無毒基因、蠶豆銹菌效應蛋白、以及玉米黑粉菌（Ustilagomaydis）效應蛋白分支酸變位酶1進行生物信息學分析，在（Pst、Pgt、Mlp）中也未發現同源基因，或者同源基因不具有無毒基因特性（Persoonsetal.2014）。這表明分泌蛋白基因家族具有較高的進化速率以及較低的保守性。子囊菌綱的黃枝孢菌效應蛋白可以分泌到胞外被寄主免疫受體所識別（DeWitetal.2009）。然而，銹菌候選的胞外分泌蛋白是否也參與寄主免疫響應有待進一步研究。Petreetal（2016）通過將Mlp候選的效應蛋白注射本氏煙的方法研究其亞細胞定位，結果顯示六個效應蛋白定位于細胞核、核仁、葉綠體、線粒體和細胞外。其中一個效應蛋白葉綠體靶蛋白1可以模擬寄主轉運肽進入葉綠體和線粒體，表明這些效應蛋白可能操縱線粒體和葉綠體來完成其專性寄生。
5銹菌的基因丟失與生活方式演化
銹菌是活體營養的專性寄生菌，不能人工培養。推測銹菌在進化的過程中可能丟失了部分腐生性營養擔子菌類所特有的某些基因。比較分析21種已測序不同營養型真菌基因組中碳水化合物激活酶類基因成分發現，Mlp和Pgt具有相對較少的糖苷水解酶編碼基因，數量和擔子菌綱的雙色蠟蘑較為相似，但是相比半活體營養型、死體營養型和腐生型生物則要少很多。在進化為活體專性營養型的過程中，銹菌類真菌已經失去了一些編碼分泌糖苷水解酶和多聚糖裂解酶的基因。但是，編碼一些清除植物纖維素和半纖維素的糖苷水解酶的基因家族，例如GH7、GH10、GH12、GH26和GH27均出現了輕微的擴增。這些酶可能在銹菌侵染寄主的初始階段起主要作用，例如蛋白酶、酯酶和一些碳水化合物激活酶類基因在被侵染的植物體內表達量高度上調，表明這些侵入菌絲可以通過水解酶類穿透進入寄主細胞（ElGueddarietal.2002）。銹菌通過侵入的菌絲在寄主體內形成吸器來獲取糖類和氨基酸等養分對于成功建立起活體專性營養型互作具有重要意義。Mlp、Pgt和Mli缺失了一些參與硝酸鹽同化吸收的基因，例如硝酸鹽和亞硝酸鹽轉運蛋白以及亞硝酸鹽還原酶。Mlp具有基本的硫素同化吸收相關基因，而Pgt、Pst則沒有。Pgt缺少了亞硫酸鹽還原酶（SiR）的α和β亞基，而Mlp的SiR的β亞基缺失，導致失去轉酮醇酶活性，但是在亞麻柵銹菌（Mli）中存在完整的硫素代謝途徑。銹菌缺失部分氮素和硫素同化吸收相關途徑與他們專性活體寄生方式一致，它們可以通過擴張的轉運蛋白家族直接從寄主植物細胞獲取氮素（NH4+或氨基酸）和硫素（Spanu，2012）（圖4）。銹菌可能通過丟失一些非必需基因來平衡其大進化（macroevolution）壓力。
6銹菌基因組變異與毒性演化
在銹菌中，還未發現像水稻大角間座殼那樣由于大片段缺失造成分泌蛋白缺失而引起的毒性變異。甚至在比較毒性差異最大的不同生理小種分泌蛋白組時，也沒有在任何一個小種中發現超過15個預測的分泌蛋白基因缺失。這表明基因的缺失可能不是造成銹菌毒性改變的主要原因，而不同生理小種的分泌蛋白等位基因的變異可能是造成毒性變異的重要原因。通過重測序4個不同毒性的條形柄銹菌小麥專化型生理小種，生物信息學分析鑒定不同小種候選效應蛋白基因的單核苷酸多態性（SNP）變異，在2999個分泌蛋白中發現5個候選多態性分泌蛋白基因。這些多態性分泌蛋白可能反應不同生理小種條形柄銹菌小麥專化型對特定基因型寄主小麥的快速適應性。Zhengetal（2013）以Pst‐CY32參照基因組，對5個世界范圍的重要流行菌系（CY23、PK‐CDRD、Hu09‐2、104E137A‐、Pst‐78）進行重測序分析，檢測到超過100000個SNPs。同時還發現不同菌系還存在豐富SV、InDel等遺傳變異。其中，分布于編碼區的cSNPs占總共SNP數量的35%，這些SNPs可能影響銹菌小種毒性和寄生特性的演化。以此全基因組SNP數據構建的6個菌系的進化關系顯示，Pst分離系之間有明顯的遺傳分化，有性生殖可能在其毒性演化過程中發揮了重要作用。通過對15個落葉松‐楊柵銹菌不同毒性分離系進行了重測序，結果顯示與Mlp‐98AG31基因組相比，不同菌系存在大量的單核苷酸變異（SNVs）、多核苷酸變異（MNVs；連續的SNVs）和短序列的插入/缺失變異（InDels）。同時，落葉松‐楊柵銹菌16%的基因上游1000bp區段有超過10個SNPs，表明這些區段可能與基因表達調控有關。
重復序列誘導的點突變是真菌所特有的一種真核生物基因沉默機制，1987年在粗糙脈孢菌Neurosporacrassa中首次發現。Hornseta（l2012）通過對來自擔子菌門3個不同亞門（傘菌亞門、黑粉菌亞門、柄銹菌亞門）的8種擔子菌轉座子的變異分析發現在柄銹菌亞門的落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）和禾柄銹菌小麥專化型（Pgt）中存在大量的RIP情況。在Mlp和Pgt中RIP主要發生在Gypsy類轉座子的TpCpG三核苷酸區域，使TpCpG轉換成為TpTpG，從而形成富含T+A的片段。而在傘菌亞門和黑粉菌亞門中均未發現此類現象。重復序列誘導點突變（RIP）在減數分裂過程中通過突變多拷貝DNA，能最大限度地減少轉座子的影響，這一特性被認為是為轉座子傳播提供的一種防御機制。此外，發生RIP的序列多集中在著絲粒區域，主要是轉座子甲基化后的痕跡。
7結語
銹菌類真菌基因組巨大、雜合度高，菌系地理分布廣泛、生態位多樣，蘊含著眾多基因組進化待解之謎。目前，高通量測序的低成本化和第三代測序技術的成熟化為銹菌結構基因組學提供了前所未有的機遇，通過基因組精細測序、群體重測序以及比較基因組學分析可以更深入地揭示銹菌寄生專化性進化和毒性變異的遺傳基礎。對基因組變異的深入研究將為最終在分子水平揭示其毒性變異機制提供理論依據，為預測新的生理小種的產生及銹病防治提供有力工具。
作者：焦志鑫 申一林 李晶晶 許君 劉娜 康振生 鄭文明 單位：河南農業大學生命科學學院 小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南糧食作物協同創新中心 西北農林科技大學植物保護學院 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室