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《菌物學報》2016年第四期
摘要：
采用杯碟法對大蟬蟲草搖瓶發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物進行了抗菌實驗，并利用質譜導向的制備高效液相色譜對該乙酸乙酯萃取物中的活性組分進行了跟蹤分離得到抗菌活性化合物，根據該化合物的理化性質和波譜數據鑒定其化學結構。結果發(fā)現(xiàn)大蟬蟲草發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌有明顯的抑制作用，確定白色念珠菌為研究大蟬蟲草發(fā)酵液抗菌活性的最佳指示菌；從大蟬蟲草發(fā)酵液中分離得到的抗真菌活性化合物為多殼球菌素。
關鍵詞：
大蟬蟲草，抗菌活性，分離，鑒定，多球殼菌素
大蟬蟲草Cordycepscicadae(Miq.)Massee分布于浙、皖、閩、贛等地，在浙江民間稱“獨角龍”。曾有學者認為大蟬蟲草是蟬花Isariacicadae的有性型（幸興球1975），但兩者相似之處僅在于寄主都是蟬若蟲。蟬花和大蟬蟲草C.cicadae，無論在形態(tài)上，還是遺傳水平上均有顯著差別，是兩個完全不同的種類（研究中）。王文元和劉曉光（1991）在杭州境內采到了大蟬蟲草，并對其生長環(huán)境和形態(tài)特征作了描述，基本與幸興球報道的一致，并證明大蟬蟲草中含有肝糖、蟲草酸和多種生物堿等活性物質。長期以來，大蟬蟲草被人們同蟬花混淆，作為中藥材進行了大量的藥理研究。報道表明蟬花具有滋補強壯（陳萬群和陳古榮1994）、抗疲勞抗應激（王硯等2001）、鎮(zhèn)靜催眠（劉廣玉和胡菽英1991）、免疫調節(jié)（遲秋陽等1996）等作用，而對于大蟬蟲草的藥理作用還有待進一步研究。目前，國內外對于大蟬蟲草研究的報道甚少，未見到對大蟬蟲草抗真菌活性的報道，該菌也沒有列入中國藥用真菌名錄（戴玉成和楊祝良2008）。雖然有少量用了大蟬蟲草拉丁名的文獻因為分類問題故不在研究背景之列，本研究首次對其抗真菌活性和抗菌物質分離鑒定進行了研究。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1材料、試劑：大蟬蟲草Cordycepscicadae由安徽農業(yè)大學蟲生真菌研究中心分離純化，菌株命名編號為RCEF6202。枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis、黑曲霉Aspergillusniger由安徽農業(yè)大學生命科學學院提供；白色念珠菌Canidiaalbicans安徽醫(yī)科大學微生物所提供。甲醇（色譜純，美國Tedia公司），乙腈（色譜純，美國Tedia公司），甲酸（色譜純，美國Tedia公司），水為超純水，其他試劑均為分析純級。
1.1.2儀器與設備：SENCOR‐501真空旋轉蒸發(fā)儀（上海申勝公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent6460/1260液質聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；Waters600E‐2767質譜引導全自動制備純化系統(tǒng)（美國Waters公司）；AgilentDD2600MHz超導傅立葉變換液體核磁共振波譜儀（美國Agilent公司）。
1.2方法
1.2.1大蟬蟲草發(fā)酵液萃取物的制備：將培養(yǎng)好的大蟬蟲草菌株RCEF6202配制成109CFU/mL的菌懸液，按15%（V/V）的接種量接種到裝有250mL沙氏培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25℃、150r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。抽濾獲得濾液后，50℃真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮約至原體積的1/5，加入等體積的乙酸乙酯（秦建春等2006），室溫，150r/min震蕩萃取2h。靜置分層后，100Hz，50℃超聲至上清液澄清，吸取上清液。再按上述方法重復萃取一次，將兩次萃取的上清液混合。利用SENCOR‐501真空旋轉蒸發(fā)儀，50℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，獲得膏狀物，得大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物約為1g。
1.2.2抗菌實驗（杯碟法）：分別將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、黑曲霉和白色念珠菌配制成107CFU/mL的菌懸液，取該6種菌懸液200μL均勻涂布于裝有固體LB培養(yǎng)基的平皿上，用無菌鑷子夾取滅過菌的牛津杯放置于平皿菌層上，加入1.3.1中濃度為30mg/mL的大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物200μL于杯內。最后將涂布有枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌的平皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；黑曲霉的平皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h；白色念珠菌的平皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（陳安徽等2008）。每種菌設置3個平行組，同時每組設置乙酸乙酯對照。
1.2.3抗菌活性組分HPLC分離條件：利用Agilent1200高效液相色譜儀，確定大蟬蟲草乙酸乙酯萃取物組分分離的條件：稱取1.3.1中得到的乙酸乙酯萃取物300mg，加入10mL的乙酸乙酯，100Hz、50℃浸提1h，置于4℃冰箱過夜后，10000r/min離心10min取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，備用。分離條件：色譜柱為AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），流動相為甲醇：水=4：6，兩相中均加入5‰的甲酸，進樣量：20μL，流速：0.5mL/min，檢測波長：201nm，柱溫：25℃。
1.2.4抗菌活性成分的跟蹤分離：用Waters600E‐2767質譜引導全自動制備純化系統(tǒng)分離1.3.1中得到的乙酸乙酯萃取物，流動相與1.2.3中相同，進樣量1mL，流速為17mL/min。將每個峰收集的分離液進行濃縮，分別進行白色念珠菌的杯碟法抗菌試驗，確定抗菌活性成分。
1.2.5抗菌活性成分的制備：根據1.2.4中確定的抗菌活性成分的分離條件，多批次進樣，利用Waters600E‐2767質譜引導全自動制備純化系統(tǒng)大批量分離制備，累計目標流分，濃縮，冷凍干燥得抗菌活性成分。
1.2.6抗菌活性成分的LC‐MS分析：利用Agilent6460/1260液質聯(lián)用儀進行LC‐MS分析，得出該抗菌活性成分的分子量等初步理化性質。色譜條件：色譜柱：AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），進樣10μL，柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動相A：水，流動相B：乙腈，兩相中均加入1‰的甲酸，洗脫條件：0–10min，10%–100%B；10–20min，100%B。質譜條件：流速10L/min，霧化氣壓35psi，陽離子模式采集，毛細管電壓4000V，破碎電壓215V，采集范圍m/z：150–1000。
1.2.7抗菌活性成分的NMR分析：將目標化合物轉移至核磁管中，加入氘代二甲基亞砜溶解，用AgilentDD2600MHz超導傅立葉變換液體核磁共振波譜儀測定其NMR譜圖，得出該化合物的相關波譜數據，推斷其化學結構。
2結果與分析
2.1大蟬蟲草抗菌活性測試結果大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抗菌活性測試結果見表1。大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對黑曲霉和白色念珠菌有抑菌作用，對其他供試菌均無抑菌作用，尤其對白色念珠菌的抑制作用最為明顯。大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物抑制白色念珠菌的效果見圖1。結果顯示，牛津杯中加有乙酸乙酯萃取物的實驗組平均抑菌圈直徑約為27.83mm（以上抑菌圈直徑均包括牛津杯的直徑7.76mm在內），加乙酸乙酯的對照組的抑菌圈直徑為零，即說明大蟬蟲草發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物有較強的抑制白色念珠菌的活性。因此，確定白色念珠菌為研究大蟬蟲草發(fā)酵液抗菌活性的最佳指示菌。
2.2抗菌活性成分的制備分離及抗菌活性將1.2.1中的制備好的萃取液，按照1.2.3所述的色譜條件進行HPLC分析，圖2為波長在201nm下的波譜圖。利用Waters600E‐2767質譜引導全自動制備純化系統(tǒng)，分離大蟬蟲草乙酸乙酯萃取液形成不同的組分峰，收集每單個峰流出的組分，分別檢測不同出峰時間收集的組分對白色念珠菌的抗菌活性，結果表明在10.5min對應的峰下收集的組分有抗菌活性，抗菌效果圖見圖3。圖3中抑菌圈的平均直徑約為18.85mm。
2.3抗菌活性成分的LC‐MS分析將2.2中10.5min左右收集分離得到的抗菌活性組分進行LC‐MS分析，該組分在陽離子模式下的質譜圖如圖4、圖5所示，在陽離子模式下的離子峰（m/z）為402.4，根據ESI離子化特征，可知該峰為準分子離子峰[M+H]+,其相對分子質量應為401.4。
2.4抗菌活性成分的純度檢測取少量1.2.5中制備干燥的抗菌成分，溶于甲醇，用HPLC進行純度分析，結果見圖6。利用峰面積歸一法計算出該抗菌活性成分的純度為95.8%。
3結論
本研究對大蟬蟲草發(fā)酵液抗真菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌有明顯的抑制作用。同時，對大蟬蟲草中抗真菌活性成分進行了分離并對目標化合物進行了結構鑒定。分離鑒定的過程采用了高效液相色譜探索分離條件。實驗證明色譜柱為AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），流動相為甲醇:水=4:6，兩相中均加入5‰的甲酸，進樣量：20μL，流速：0.5mL/min，檢測波長：201nm的條件下，能分離出抗真菌成分。進一步通過質譜導向的制備純化系統(tǒng)分離得到單一抗菌物質。綜合MS和NMR等數據，可鑒定該抗菌活性化合物為多殼球菌素。多球殼菌素已被證實能有效地抑制白色鏈珠菌的生長，顯示多種顯著的藥理作用（徐紅娟等2010；Banfietal.1985），已于臨床廣泛研究。本實驗從大蟬蟲草中分離出多球殼菌素尚屬首次，為該蟲草資源的研究與開發(fā)提供實驗依據。
作者：胡凱 程文明 李春如 單位：安徽農業(yè)大學生命科學學院 安徽醫(yī)科大學藥學院 浙江泛亞生命科學研究院