林蛙油生物活性肽研究范文

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《吉林農業大學學報》2016年第3期

摘要：

采用響應面法對林蛙油生物活性肽的制備工藝進行優化，并對活性肽進行抗疲勞作用研究。結果表明：超聲波輔助酶法制備林蛙油生物活性肽，木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為料液比1%、酶用量0.3%、溫度60℃、時間4h、pH5.5，水解度為13.5%。動物試驗結果表明：高劑量組小鼠的負重游泳時間是對照組的2.3倍，低劑量組的轉棒時間是對照組小鼠的2.73倍，中劑量組小鼠的爬桿時間是對照組的2.8倍；小鼠的血清尿素氮和血乳酸含量分別減小了72.7%和86.5%，說明林蛙油生物活性肽能夠緩解疲勞感的產生。

關鍵詞：

林蛙油；生物活性肽；抗疲勞作用

隨著生活節奏的加快及工作壓力的增加，人們越來越容易感覺到疲勞，這種現象與機體能量消耗和狀態修復有直接關系[1-4]，疲勞現象產生后，可以導致機體運動能力降低、中樞神經系統驅動源減少、神經肌肉接點效率降低等[5]，如不及時對疲勞現象進行狀態修復會對機體的骨骼肌、心肌等造成危害[6,7]，如慢性疲勞綜合癥（CFS）就是由于疲勞現象所引起的疾病[[8,9]。生物活性肽作為一種天然制備產物無毒副作用備受關注，研究表明生物活性肽具有抑菌、抗癌、抗疲勞、抗氧化、降膽固醇等生理功能[10-12]。林蛙油味甘、性平，系雌性林蛙的干燥輸卵管，其主要成分是蛋白質，研究表明，蛋白質在人體內要水解為小分子肽才能更好的發揮其生理作用，因此本研究采用酶工程的方法以林蛙油為原料將其水解為肽類物質，并通過動物試驗研究其抗疲勞作用。

1材料和方法

1.1試驗材料與儀器設備

1.1.1試驗材料林蛙油長白山北亞藥業有限公司；木瓜蛋白酶（400U/mg），購自上海鼎國生物工程有限公司；其他均為分析純，購自上海鼎國生物工程有限公司。尿素氮試劑盒，購自長春匯力生物技術有限公司；血乳酸試劑盒，購自南京建成生物技術有限公司。

1.1.2儀器設備infinitieM200酶標儀，NanoQuant；FE20KpH計，瑞士梅特勒；Z36HK型高速離心機，德國HERMLE公司；FD-1B50型冷凍干燥機，北京博醫康儀器有限公司；UV-1700型分光光度計，日本島津。

1.2方法

1.2.1林蛙油生物活性肽的制備工藝準確稱取適量林蛙油，按照一定料液比混合發制，打漿，超聲波（400W）處理30min，進行木瓜蛋白酶水解，4h后沸水浴滅酶15min，冷卻后4500r/min離心15min，將上清液冷凍干燥備用[13]。

1.2.2茚三酮法測定林蛙油生物活性肽的水解度（DH）[14]將烘干至恒重的甘氨酸稀釋成2-20μg/mL的溶液用于繪制標準曲線橫坐標；取2mL稀釋液和1mL顯色劑于試管中，充分混勻后沸水浴加熱15min，同時作空白對照；15min后取出試管冷水迅速冷卻，加入5.0mL40%乙醇溶液混勻后放置15min，用1cm比色杯以空白對照管調零于570nm處測其吸光度作為標準曲線的縱坐標。取蛋白水解液0.5mL定容在50mL容量瓶中，取出4mL稀釋液與1.6mL蒸餾水、1.0mL顯色劑混勻于試管中，操作同標準曲線，即可計算出蛋白水解液中-NH2的含量（μmol/mL）。

1.2.3林蛙油生物活性肽的抗疲勞能力評價

1.2.3.1動物分組ICR小鼠，體重18-22g，雄性。購自吉林大學基礎醫學院實驗動物研究中心；試驗設三個劑量組和一個對照組，給藥劑量分別為：低劑量100mg/kg，中劑量200mg/kg，高劑量400mg/kg，對照組給予蒸餾水，給藥方式為灌胃，受試樣品給予小鼠時間為30天。

1.2.3.2小鼠負重力竭游泳抗疲勞試驗采用50cm×50cm×40cm游泳箱，水深≥30cm，水溫25℃±1.0℃，末次給予受試樣品30min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間。

1.2.3.3轉棒疲勞試驗在1.2.3.1中試驗動物末次給藥后30min上轉棒疲勞儀，記錄小鼠在棒時間。

1.2.3.4爬桿試驗在1.2.3.1中試驗動物末次給藥后30min進行爬桿，記錄小鼠在桿時間。

1.2.3.5血清尿素氮測定在1.2.3.1中試驗動物末次給予受試樣品30min后，在溫度30℃游泳箱中不負重游泳90min，休息60min后，眼球采血。分離血清，按照試劑盒操作方法測定各組小鼠血清中尿素氮含量。

1.2.3.6血乳酸測定在1.2.3.1中試驗動物末次給予受試樣品30min后，采血20μL，在溫度為30℃游泳箱中不負重游泳10min，立即采血20μL，休息20min后，立即采血20μL。按試劑盒操作方法測定不同時間小鼠全血中乳酸含量。

1.2.4統計處理采用GraphPadPrism軟件系統處理試驗數據，試驗結果以平均數±標準差的形式表示，利用方差分析和t檢驗等方法對所獲結果進行統計學的分析。P＜0.05被認為有統計學意義。

2結果與討論

2.1木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝條件

2.1.1料液比對水解工藝的影響配置料液比分別為0.5:100,1:100,1.5:100,2:100,2.5:100林蛙油蛋白溶液，經超聲波預處理后按加酶量0.3%，酶解時間3h，酶解溫度60℃處理樣品，研究料液比對水解工藝的影響。 圖1為不同料液比條件下，林蛙油水解度的變化。由圖可知，隨著料液比的變化對水解度的影響很大，隨著料液比從0.5:100增加到1:100時，林蛙油水解度迅速增加，并達到最高值；隨著料液比的繼續增大，林蛙油水解度逐漸減小，說明過多的蛋白質分子會形成網狀聚合物抑制酶解反應，所以水解林蛙油生物活性肽適宜的料液比為1:100時。

2.1.2加酶量對水解工藝的影響從圖2可知隨著加酶量的升高，水解度也隨之增大；當加酶量在0.3%時，林蛙油生物活性肽的生成率達到了一個穩定水平，此時酶將蛋白分子幾乎完全催化斷裂，隨著加酶量繼續升高，對水解度的影響也不顯著。所以，林蛙油生物活性肽的水解工藝中最適加酶量為0.3%。

2.1.3酶解時間對水解工藝的影響如圖3所示，隨著酶解時間的延長，水解度也越來越高，酶解反應在1h到4h之間水解度一直呈上升趨勢，4h后上升趨勢明顯變緩不利于蛋白水解，可見反應在4h時已趨于穩定。所以選擇酶解時間為4h為最佳條件。

2.1.4pH對水解工藝的影響由圖4可知，pH值從4.5增加到5.5，水解度呈上升的趨勢，當pH值從5.5增加到6.5時，水解度呈下降趨勢，說明林蛙油在水解工藝中的適宜pH值為5.5。在單因素試驗的基礎上運用響應面法優化水解工藝條件，考察料液比、加酶量、酶解時間和pH值對水解工藝的影響。

2.1.5響應面法優化木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝本研究在單因素試驗的基礎上確定各影響因素水平范圍，進而優化林蛙油生物活性肽的制備工藝，為林蛙油提高水解率提供相關的理論依據。響應面試驗因素水平與編碼（表1）以及試驗結果（表2）如下表所示：由表3方差分析結果可知，本試驗所建立的模型顯著（P=0.0241＜0.05）,失擬項不顯著（P=0.1502＞0.05），說明該模型擬合程度較好，可用于木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝條件的分析和預測。方差分析還表明，回歸模型中A、C2對Y值的影響極顯著，A2、B2對Y值的影響顯著。根據DesignExpert8.0.6軟件分析可得響應面的3D和等高線圖，如圖5所示。經分析可知，制備林蛙油生物活性肽的最佳條件是：加酶量0.3%，料液比為1:100，酶解時間為4h，pH為5.5，此時林蛙油水解度為13.5%。為驗證模型的準確性，在最佳制備工藝條件下進行3次平行試驗的平均值為13.32%，與預測值相近，表明響應面法所得的模型準確可靠。

2.2林蛙油生物活性肽對小鼠的抗疲勞作用

2.2.1林蛙油生物活性肽對小鼠負重游泳的影響負重力竭游泳試驗不僅可以體現機體的抗疲勞能力，還能反應出機體對外界不良環境的抵抗能力和應激能力。由表4可知，低、中、高劑量組小鼠在負重力竭游泳試驗中均比對照組游泳時間長，其中高劑量組效果最為明顯（p<0.001），是對照組的2.3倍。各劑量組能夠顯著延長運動小鼠負重力竭游泳的時間，亦可說明林蛙油生物活性肽具有一定的抗疲勞功效。

2.2.2林蛙油生物活性肽對小鼠轉棒疲勞試驗的影響小鼠在轉棒儀上的轉動時間，是考驗小鼠抗疲勞效果的一個重要指標，如表4所示，給予林蛙油生物活性肽的低劑量組小鼠比未給予林蛙油生物活性肽的小鼠具有特別顯著差異，低劑量組的轉棒時間是對照組小鼠的2.73倍，說明林蛙油生物活性肽具有抗疲勞功效。

2.2.3林蛙油生物活性肽對小鼠爬桿試驗的影響由表4可知，與未給予林蛙油生物活性肽的對照組相比，低劑量組和高劑量組的小鼠均具有顯著延長爬桿時間，低劑量組、高劑量組差異顯著（p＜0.05），中劑量組差異達極顯著（p＜0.01），是對照組的2.8倍，由此可見林蛙油生物活性肽能顯著延長小鼠的爬桿時間。

2.2.4血清尿素氮測定機體在連續運動過程中，由于處于缺氧狀態下會造成乳酸和氨的蓄積，導致疲勞感產生[15,16]；乳酸脫氫酶作用于丙酮酸后生成血乳酸，在能量供不應求時，蛋白質分解代謝產能生成血清尿素氮。如表5可知，在游泳90min后對照組小鼠的血清尿素氮含量為5.93mmol/L，低劑量組中血清尿素氮含量繼續增加至8.96mmol/L，是對照組的1.5倍，說明小鼠劇烈運動會提高血清尿素氮水平，疲勞感急劇加增；中劑量組、高劑量組與對照組相比，分別減小了26.3%和72.7%，并且中劑量組與對照組之間差異顯著（p＜0.05），高劑量組與對照組之間具有極顯著差異（p＜0.01）。結果表明，灌胃林蛙油生物活性肽可以供給機體能力，提高小鼠的抗疲勞能力，亦具有一定的抗疲勞功效。

2.2.5血乳酸測定在長時間劇烈運動過程中，肌肉耗氧量的增加會導致機體缺氧狀態加速糖酵解產生乳酸，所以乳酸含量越高，疲勞感就越強[17,18]。表6是分別測定小鼠在游泳前、游泳時、游泳后血乳酸含量，結果表明：游泳前中劑量組的血乳酸相比于對照組減小了86.5%，效果極其顯著；游泳后，高劑量組相比于對照組減小了50%，具有差異顯著性。

3結論

本研究優化了林蛙油生物活性肽的制備工藝，通過響應面優化工藝為：木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為料液比1%、酶用量0.3%、溫度60℃、時間4.0h、pH5.5，水解度為13.5%。通過動物試驗表明，林蛙油經過木瓜蛋白酶水解后具有抗疲勞功能。

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作者：姜麗冬 金鑫 樸春紅 王玉華 胡耀輝 于寒松 單位：吉林農業大學食品科學與工程學院