轉(zhuǎn)染基因?qū)νN大鼠皮膚移植的影響范文
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【摘要】目的構(gòu)建攜帶免疫調(diào)節(jié)因子vIL-10cDNA的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。篩選后對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔種植，4周后移植同種異體全層皮膚，觀察大鼠對(duì)異體皮膚的免疫排斥反應(yīng)。方法PCR擴(kuò)增原核載體PET-28α/vIL-10，獲得目的基因vIL-10，目的基因在大腸桿菌中擴(kuò)增后連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。用G418篩選得到vIL-10高表達(dá)的細(xì)胞，腹腔種植于大鼠體內(nèi)，對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染的骨髓基＋質(zhì)干細(xì)胞。四周后異體植皮，7d后拆線、觀察皮膚生長(zhǎng)情況并采血使用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析外周血中CD3、＋＋CD4、CD8細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果vIL-10cDNA真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；同種異體植皮一周后應(yīng)用vIL-10cDNA真核表達(dá)載體可以提高大鼠移植皮膚的存活質(zhì)量；通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)淋巴細(xì)胞亞型分析++++結(jié)果顯示，應(yīng)用vIL-10cDNA真核表達(dá)載體的大鼠血液中CD3/CD4絕對(duì)數(shù)值、CD4/CD8的比值均比對(duì)照組和空白組高。結(jié)論轉(zhuǎn)染vIL-10基因可以降低大鼠全層皮膚移植后的免疫排斥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】病毒白細(xì)胞介素-10；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；免疫排斥反應(yīng)；皮膚移植
既往研究表明，異體皮膚移植有望成為解決燒傷病人皮源不足問(wèn)題的有效方法，但異體間的免疫排斥反應(yīng)一直是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)難以跨越的鴻溝。vIL-10被認(rèn)為是一種抑制同種異體移植免疫排斥反應(yīng)的較理想細(xì)胞候選因子，而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可以在體內(nèi)微環(huán)境的誘導(dǎo)下分化為成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞，且因其具有來(lái)源可靠、體外易擴(kuò)增及不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)成為首選種子細(xì)胞。異體移植的成功與否主要取決于個(gè)體間的免疫排斥反應(yīng)的大小，我們通過(guò)構(gòu)建vIL-10的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，植入大鼠體內(nèi)，觀察vIL-10在MSCs中的高表達(dá)對(duì)異體移植間的免疫排斥反應(yīng)有無(wú)抑制作用。
1材料與方法
1.1材料
成年Wistar大鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DH-5α大腸桿菌菌株和表達(dá)載體pcDNA3.1(+)均由濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室梁淑娟博士惠贈(zèng)。PET-28α/vIL-10質(zhì)粒由福州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科吳玉水博士惠贈(zèng)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、G418sulfate、DNA限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶分別購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司、加拿大BBI公司及MBI公司，UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒、UNIQ-10柱式質(zhì)粒少量抽提試劑盒、AMVsinglestepRT-PCRkit均購(gòu)自上海生物工程公司。Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-ratCD3、Phycoerythrin（PE）anti-ratCD8a、PEanti-ratCD4均購(gòu)自BD公司。
1.2真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/vIL-10的構(gòu)建和純化
根據(jù)Genbank提供的EB病毒基因組DNA中編碼的vIL-10的BCRF1基因序列，PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)該序列的上下游引物。對(duì)引物分別引入EcoRI、XhoI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，同時(shí)在上游引物引入起始密碼子以提高目的基因與質(zhì)粒表達(dá)載體連接的效率，上游引物命名為P1（5'-CGGAATTCATGGAGCGAAGGTTAGTG-3'），下游引物命名為P2（5'-CGCTCGAGTCACCTGGCTTTAATTGT-3'），通過(guò)PCR法擴(kuò)增目的基因，經(jīng)EcoRI、XhoI酶切回收目的基因片段并與pcDNA3.1(+)酶切載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5α大腸桿菌，菌落PCR鑒定、質(zhì)粒抽提pcDNA3.1(+)/vIL-10后酶切、測(cè)序鑒定，得到正確連接的重組體。
1.3MSCs體外分離和培養(yǎng)
將大鼠脫頸處死后置于75%酒精中浸泡10min，無(wú)菌條件下分離出股骨和脛骨。用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗大鼠骨髓腔，將骨髓液吹打制成單細(xì)胞懸液并通過(guò)200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，1500rpm離心5min，52以4×10/cm接種于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，置于37℃、5%CO、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱2中培養(yǎng)，隔天換液，待10-14d細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片后，傳代培養(yǎng)。
1.4vIL-10高表達(dá)細(xì)胞的篩選
按照LF2000脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，高純度的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/vIL-10轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)良好的第二代MSCs，在濃度不斷升高的含G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，最終得到能抵抗G418濃度為300㎎/L的細(xì)胞，分別命名為G418-100、G418-200、G418-300。
1.5轉(zhuǎn)化細(xì)胞中vIL-10的表達(dá)
UNIQ-10柱式骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的總RNA抽提以未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照，收集轉(zhuǎn)染組與對(duì)6照組各約1×10個(gè)細(xì)胞，加入350μlRLTSolution，震蕩裂解，收集細(xì)胞總RNA。將得到的RNA在微量核酸定量?jī)x上測(cè)定OD和OD值，計(jì)算OD/OD比260280260280值，分析總RNA純度。取10μl作為模板RNA，通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)結(jié)束后取5μl樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.6動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)
取20只Wistar純種大白鼠，體重200-260g，鼠齡3-5個(gè)月，隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組（A）、陰性對(duì)照組（B）、空白對(duì)照組（C）。胰酶消化G418篩選后的高表達(dá)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌3次，42PBS重懸，得到6×10/cm的細(xì)胞懸液；按1ml/只腹腔注射于實(shí)驗(yàn)組大白鼠，陰性對(duì)照組注射等量未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞懸液，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。合籠飼養(yǎng)4周。異體植皮取A、B、C組Wistar大鼠各一只做為供皮組，腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g），取皮備用。同法麻醉其他實(shí)驗(yàn)組大鼠，剪除背毛，消毒局部皮膚，成品字形在背部做三個(gè)直徑約1.2cm的圓形全層皮膚缺損。在缺損處分別植入A、B、C供皮組皮膚，打包加壓縫合。同法處理對(duì)照組和空白組大鼠。
2結(jié)果
2.1重組載體pcDNA3.1(+)/vIL-10的構(gòu)建及鑒定
以原核質(zhì)粒PET-28a/vIL-10為模板，利用pfuDNA聚合酶的高保真性能，擴(kuò)增vIL-10基因。產(chǎn)物回收純化后，經(jīng)EcoRI和XhoI限制性酶切，獲得目的基因片段，同時(shí)對(duì)pcDNA3.1(+)進(jìn)行EcoRI和XhoI限制性酶切，獲得表達(dá)載體大片段，純化的目的基因酶切片段和表達(dá)載體酶切片段，按照3~5：1比例進(jìn)行連接構(gòu)建后，轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)菌株，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落，單菌落培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落PCR鑒定（圖1），PCR陽(yáng)性者進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提后，再利用EcoRI和XhoI進(jìn)行限制性酶切鑒定，可見(jiàn)切出一大小約510bp的目的基因片段，與預(yù)期片段大小符合。最后將重組質(zhì)粒做DNA序列分析，確認(rèn)獲得pcDNA3.1(+)/vIL-10真核表達(dá)載體。2018年第24卷第6期高學(xué)軍等轉(zhuǎn)染vIL-10基因?qū)νN大鼠全層皮膚移植的影響•633•
2.2MSCs的體外培養(yǎng)
接種24h后可見(jiàn)成纖維狀細(xì)胞以散在方式貼壁生長(zhǎng)，多數(shù)為梭形的成纖維狀細(xì)胞，也可見(jiàn)一些圓形的內(nèi)皮樣細(xì)胞，傳代后細(xì)胞基本呈均勻性生長(zhǎng)（圖2）。
2.3總RNA抽提和目的
基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖3，4）
2.4異體植皮（圖5）
2.5植皮一周后大體觀察（圖6)
全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后均未發(fā)生感染、體液滲出等不良反應(yīng)。傷口包扎對(duì)動(dòng)物的活動(dòng)亦無(wú)明顯影響。攝食、飲水，排便情況正常，均成活至完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組移植皮膚與正常皮膚邊界相互融合，顏色比正常皮膚紅潤(rùn)，移植皮膚與創(chuàng)面黏附較好；對(duì)照組和空白組移植皮膚有少部分與正常皮膚邊界融合，四周有少許結(jié)痂，創(chuàng)面黏附不如實(shí)驗(yàn)組，移植物顏色較正常皮膚深。
2.6流式細(xì)胞儀對(duì)淋巴細(xì)胞亞型分析結(jié)果
T淋巴細(xì)胞，主要?dú)≡w感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，其表面標(biāo)志物CD3，與TCR形成復(fù)合體，是T細(xì)++胞識(shí)別抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的主要單位。CD3/CD4：輔++助性T細(xì)胞，CD3/CD8：殺傷性T細(xì)胞，++CD4/CD8的比值：評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷病人的免疫狀態(tài)。++流式結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組CD3/CD4絕對(duì)數(shù)值、++CD4/CD8的比值均比對(duì)照組和空白組高。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組：A.001右上角為CD4/CD3、CD8/CD3雙陽(yáng)性T細(xì)胞，分別占淋巴細(xì)胞的27.32%、25.72%；陰性對(duì)照組：CD4/CD3、CD8/CD3雙陽(yáng)性T細(xì)胞，分別占淋巴細(xì)胞的10.41%、27.05%；空白對(duì)照組：CD4/CD3、CD8/CD3雙陽(yáng)性T細(xì)胞，分別占淋巴細(xì)胞的14.49%、21.94%。
3討論
vIL-10是EB病毒編碼的一種人白細(xì)胞介素[1]10（IL-10）的類(lèi)似物，vIL-10可直接作用于T細(xì)胞，抑制B7受體如CD28、CTLA4介導(dǎo)的共刺激信號(hào)[2]。vIL-10作為一個(gè)具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子[3]，在器官移植方面獲得廣泛研究。局部轉(zhuǎn)染vIL-10可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)同源和異源移植腫瘤不排斥，用vIL-10蛋白處理骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞或用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)[4]導(dǎo)vIL-10可使T細(xì)胞功能降低。大量不同的T細(xì)胞亞群已被證實(shí)具有體內(nèi)外免疫[5]++抑制作用，CD3/CD4：輔助性T細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子，具有輔助其它免疫細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)免疫++應(yīng)答的作用。CD3/CD8：殺傷性T細(xì)胞，它在T細(xì)胞++免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。CD4/CD8比值可用于評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑免疫失調(diào)或已知患有++免疫缺陷病人的免疫狀態(tài)，CD4/CD8升高見(jiàn)于自身[6-7]++免疫性疾病、免疫耐受等。CD4/CD8降低見(jiàn)于病[8-9]毒感染，惡性腫瘤，再生障礙性貧血等。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是起源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs由于具有易獲取、體外擴(kuò)增迅速、容易轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)而[10]成為理想的基因治療載體。目前的干細(xì)胞移植治療通常分為3種：增殖后直接移植、誘導(dǎo)分化后移植和干細(xì)胞經(jīng)基因修飾后移植。將各種因子的基因通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù),使其在種子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然后將這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于組織工程構(gòu)建,在實(shí)驗(yàn)研究中已獲得成[11]功，比如BMP22、BMP24、BMP27、BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，可加速成骨過(guò)程及骨修復(fù)能力。不同基因修飾后，干細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞生物學(xué)和/或分子生物學(xué)的變化，這種基因相關(guān)的個(gè)性改變應(yīng)逐一進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定干細(xì)胞為種子的細(xì)胞治療和組織工程治療的有效性。本實(shí)驗(yàn)采用的是構(gòu)建真核表達(dá)載體直接轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，因此沒(méi)有必要研究外源基因修飾后干細(xì)胞的生物學(xué)特性的改變。同種異體間的免疫排斥反應(yīng)是異體皮膚移植失敗的主要原因，誘導(dǎo)免疫耐受是增加移植皮片存活[5]的關(guān)鍵。目前應(yīng)用同種異體和異種皮膚移植治療大面積燒傷，因組織相容性不理想，會(huì)受到免疫排斥反應(yīng)而被排斥，故只能作為暫時(shí)性覆蓋創(chuàng)面之用。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)構(gòu)建攜帶vIL-10目的基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，腹腔注射于大鼠體內(nèi)，4周后異體植皮，移植皮片存活質(zhì)量提高以++及外周血CD4淋巴細(xì)胞數(shù)值升高，CD8數(shù)值降低，++CD4/CD8比值增高，這提示注射轉(zhuǎn)染vIL-10的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以降低異體移植間的免疫排斥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了攜帶vIL-10目的基因的真核表達(dá)載體，為同種異體皮膚移植基因治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供了一個(gè)新的突破點(diǎn)。
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作者：高學(xué)軍 陳振雨 蔡霞 單位：青島大學(xué)附屬醫(yī)院