亞硝化反應(yīng)器功能菌群解析范文

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《哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報》2016年第二期

摘要：

為維持亞硝化反應(yīng)器穩(wěn)定運行提供微生物理論基礎(chǔ)，以常溫（18～21．5℃）低基質(zhì)推流式亞硝化反應(yīng)器為對象，解析其穩(wěn)定運行期間功能菌群特征．通過檢測反應(yīng)器三氮變化檢驗其亞硝化效果．利用掃描電鏡（SEM）觀察污泥微觀結(jié)構(gòu)，通過熒光原位雜交（FISH）、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）及克隆測序等方法，解析微生物菌群特性．保持反應(yīng)器低溶解氧環(huán)境（0．1～0．6mg／L），使氨氧化菌（AOB）競爭力強于亞硝酸鹽氧化菌（NOB），在連續(xù)流運行80d內(nèi)，平均亞硝化率幾乎為100％，出水NO2－－N與NH4＋－N比穩(wěn)定在1．11．SEM結(jié)果顯示，亞硝化污泥中球形細菌為優(yōu)勢菌群．FISH結(jié)果顯示，AOB與NOB的相對比例分別為37．3％與4．4％．PCR－DGGE結(jié)果表明，反應(yīng)器內(nèi)存在6類優(yōu)勢微生物菌群，其中Nitrosomonassp．為功能微生物AOB．由多種微生物組成的功能菌群維持反應(yīng)器亞硝化穩(wěn)定運行．

關(guān)鍵詞：

亞硝化；功能菌群；常溫；低基質(zhì)；氨氧化菌；亞硝酸鹽氧化菌

傳統(tǒng)生物脫氮工藝經(jīng)過硝化和反硝化作用兩個階段完成脫氮過程，硝化反應(yīng)包括氨氧化與亞硝酸鹽氧化兩個過程，分別由氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）負責完成．亞硝化過程就是使硝化反應(yīng)停留在氨氧化階段，避免亞硝酸鹽被氧化成硝酸鹽，從而形成亞硝酸鹽積累．若亞硝化過程與后續(xù)厭氧氨氧化工藝耦合（PNANAMMOX），則只需要將57％的氨氧化成亞硝酸鹽，剩余的氨氮與亞硝酸鹽按如下反應(yīng)式完成脫氮過程。與傳統(tǒng)硝化／反硝化脫氮作用相比，PNANAMMOX理論上可節(jié)省62．5％的曝氣能耗，無需有機碳源，且污泥產(chǎn)量低，受到廣泛關(guān)注［2］．若要維持常溫低基質(zhì)生活污水PNANAMMOX工藝穩(wěn)定運行，關(guān)鍵在于實現(xiàn)穩(wěn)定的亞硝化過程，即PN反應(yīng)器出水NO2－與NH4＋比值穩(wěn)定，實質(zhì)就是控制條件促進AOB生長繁殖而淘汰NOB［3］．本研究以經(jīng)過厭氧－好氧（A／O）除磷工藝去除磷及大部分有機物的生活污水為對象，完成亞硝化（PN）反應(yīng)器的啟動．待PN反應(yīng)器穩(wěn)定運行后，通過掃描電鏡（SEM）、熒光原位雜交（FISH）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等技術(shù)，分析污泥微觀結(jié)構(gòu)、解析功能菌群特性，探索功能菌群與反應(yīng)器亞硝化效果之間的關(guān)系，為促進AOB富集、提高PN反應(yīng)器效能提供理論基礎(chǔ).

1實驗

1．1反應(yīng)器裝置及進水水質(zhì)反應(yīng)器裝置為不銹鋼制的推流式反應(yīng)器，后面接由有機玻璃制成的豎流式形式二沉池（圖1）．主體反應(yīng)器規(guī)格為2．0m×0．6m×1．0m，總?cè)莘e為1．2m3，分隔成4個相同大小的格室．通過設(shè)置導(dǎo)流孔防止流水返混，保持反應(yīng)器連續(xù)流運行所需的推流條件．A／O除磷工藝的出水用作推流式反應(yīng)器進水，進行亞硝化實驗．根據(jù)運行需要控制每個格室的曝氣量，通過單獨的氣體流量計檢測曝氣強度．二沉池總?cè)莘e為300L，其中部分污泥進行回流，補充反應(yīng)器污泥濃度．推流式亞硝化反應(yīng)器接種600L某污水廠曝氣池末端的污泥（6650mg／L），硝化性能良好．實驗用水為實際生活污水，即北方某生活小區(qū)化糞池污水經(jīng)過厭氧－好氧（A／O）除磷工藝去除大部分磷、COD、BOD，反應(yīng)器進水水質(zhì)如表1所示．按中國國家環(huán)保局頒布的標準方法測定進出水三氮質(zhì)量濃度［4］：氨氮，納氏試劑光度法；亞硝酸鹽氮，N－（1－萘基）－乙二胺光度法；硝酸鹽氮，紫外分光光度法．溫度、pH及溶解氧采用WTW在線pH／DO檢測．

1．2掃描電鏡（SEM）觀察收集接種污泥及反應(yīng)器啟動成功后的硝化污泥，進行掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)．方法如下：樣品加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝8．0）洗滌3次；加入體積分數(shù)為2．5％的戊二醛，于冰箱中4℃條件下固定2h；加入磷酸緩沖溶液（PBS，0．1mol／L，pH＝8．0）清洗10min；之后進行梯度酒精脫水，體積分數(shù)分別為30％、50％、70％、90％，再用無水乙醇脫水3次，每次10min；之后進行置換反應(yīng)，即加入無水乙醇與乙酸異戊酯比為1∶1及純乙酸異戊酯各1次，每次15min；對樣品進行冷凍、真空干燥24h、噴金，通過掃描電鏡（HITACHIS－4300）觀察污泥微觀結(jié)構(gòu)．

1．3熒光原位雜交（FISH）對接種污泥與硝化污泥進行熒光原位雜交分析，所用探針如表2所示，污泥樣品經(jīng)過預(yù)處理、雜交、洗滌后進行觀察［5］．雜交過程所用探針雜交液組成為：體積分數(shù)20％～55％的甲酰胺，0．9mol／LNaCl，20mmol／LTris－HCl（pH＝7．2），質(zhì)量分數(shù)0．01％的SDS；雜交后洗脫液組分為：56～225mmol／LNaCl，20mmol／LTris－HCl（pH＝7．2），10mmol／LEDTA，0．01％SDS．雜交后的玻片晾干后，通過熒光顯微鏡（BX51）及CellSensDimension軟件觀察，分析雜交結(jié)果．隨機捕捉20張FISH圖像，利用ImageProPlus6．0軟件分析AOB與NOB所占比例.

1．4變性梯度凝膠電泳（DGGE）及測序分析

1．4．1DNA提取與PCR擴增采用改進的氯仿－SDS方法提取硝化污泥微生物基因組DNA．取1g污泥，加入DNA提取液2．7mL（100mmol／LTris－HCl，100mmol／LEDTA，1．5mol／LNaCl，100mmol／LNa3PO3，質(zhì)量分數(shù)為1％的CTAB，pH＝8．0）、蛋白酶K50μL（30mg／mL）、溶菌酶50μL（20mg／mL），混勻之后在37℃水浴、225r／min條件下震蕩30min；加入0．3mL質(zhì)量分數(shù)為20％的SDS，65℃水浴2h時，期間每隔15min將樣品管輕搖混勻．水浴完成后將離心管取出，8000r／min條件下離心10min，棄沉淀；上清液加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1），混勻后離心10min（8000r／min）；上清液加入0．6倍體積的異丙醇，－20℃冷凍過夜，再在4℃、10000r／min條件下離心5min，去上清液，沉淀至通風處徹底晾干．加入100μLTE（100mmol／LTris－HCl，100mmol／LEDTA，pH＝8．0）溶解沉淀，－20℃保存?zhèn)溆茫?］．采用通用引物GC－338F和907R擴增細菌16SrRNA基因［9］．PCR反應(yīng)管內(nèi)加入提取的基因組DNA1．0μL，dNTPs（2．5mmol／L）2．0μL，引物GC－338F和907R（20μmol／L）各0．5μL，10×Buffer2．5μL，ExTaq酶（5U／μL）0．125μL，加入無菌水至終體積25μL．采用TaKaRaTP600梯度PCR儀（日本）進行PCR反應(yīng)，94℃開始變性5min；進入循環(huán)反應(yīng)，包括94℃、40s，55℃、40s，72℃、1min3個步驟，共運行30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃終止PCR反應(yīng)．利用DNA純化回收試劑盒（天根，中國）對PCR產(chǎn)物純化回收，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證．

1．4．2DGGE及其結(jié)果分析DGGE電泳儀器為美國BioRad公司的DCodeSystem系統(tǒng)．通過加入尿素與甲酰胺配置質(zhì)量分數(shù)30％～60％的變性梯度凝膠，配置質(zhì)量分數(shù)為8％的聚丙烯酰胺凝膠進行PCR產(chǎn)物分析．DGGE操作條件為：電壓120V，電泳溫度與時間分別為60℃與8h，電泳緩沖液為1×TAE．電泳結(jié)束后，將凝膠清洗之后進行銀染［10］，在凝膠成像儀（BioRad）中通過軟件GelDocXR獲取銀染后圖像．1．4．3微生物系統(tǒng)發(fā)育分析通過銀染，DGGE凝膠出現(xiàn)明顯條帶，對這些條帶進行切割，將其溶于100μL1×TE（pH8．0）中，于4℃冰箱中過夜．以此為模板，相應(yīng)不帶GC夾的338F與907R為引物，擴增細菌16SrRNA基因片段．PCR片段進行純化回收，通過T4DNA連接酶連接到載體pMD19－T（TaKaRa）上，42℃熱擊，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞EscherichiacoliDH5α（天根，中國）中．通過涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，構(gòu)建目的基因克隆文庫．每個DGGE條帶的樣品選取3～5個陽性克隆送交上海生工生物公司進行測序．獲得的序列通過BLAST工具搜索相近序列，進行比對．將序列提交到GenBank，獲得基因登錄號為KF194203－KF194209．通過MEGA5．0軟件，以bootstrapNJ法構(gòu)建相應(yīng)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹．

2結(jié)果與討論

2．1亞硝化反應(yīng)器運行效果亞硝化反應(yīng)器運行效果可用氨氧化率及亞硝化率來表征，其中氨氧化率（RA）計算方式.在之前的研究中已完成亞硝化反應(yīng)器啟動［12］，過程如下：在A／O除磷反應(yīng)器的出水中人工添加（NH4）2SO4至氨氮質(zhì)量濃度為300mg／L（游離氨FA為11．36mg／L），溫度為室內(nèi)自然溫度（16．4～25．5℃）．采用間歇操作方式，即經(jīng)過進水（0．5h）、曝氣與沉淀（1h）、排水（1h）、閑置5個階段，對接種污泥進行馴化．對曝氣強度采用實時控制策略［13］，保持DO質(zhì)量濃度0．2～0．8mg／L，避免延時曝氣．在這種工況下共運行了60個周期，出水NO2－－N與NH4＋－N比達1．0～1．30，亞硝化率一直保持90％以上，表明成功啟動亞硝化反應(yīng)器．之后將進水氨氮質(zhì)量濃度降到80mg／L，按SBR操作方式共運行40個周期，期間氨氧化率在90％左右，而亞硝化率一直在95％以上，說明反應(yīng)器在低氨氮、間歇操作方式下，能保持亞硝化穩(wěn)定運行［14］．此后，反應(yīng)器轉(zhuǎn)變?yōu)槌氐桶钡B續(xù)流運行（本文實驗），進水流量（Qin）為125～160L／h，污泥回流量（Q回）為60～80L／h，水力停留時間（HRT）為7～9h．調(diào)節(jié)反應(yīng)器4個格室的曝氣強度，分別為4～8L／min、3～4L／min、0（只進行缺氧攪拌）、3～5L／min，保持反應(yīng)器溶解氧（DO）質(zhì)量濃度處于較低水平（0．1～0．6mg／L）．整個80d運行期間，反應(yīng)器氨氧化率、亞硝化率和出水NO2－－N與NH4＋－N比如圖2所示．由圖2可知，平均氨氮氧化率穩(wěn)定在55％，亞硝化率接近100％，出水NO2－－N與NH4＋－N比穩(wěn)定在1．11附近，可為后續(xù)ANAMMOX反應(yīng)提供穩(wěn)定水質(zhì)．PN反應(yīng)器亞硝化效果良好，推測AOB得到有效富集，NOB活性受到抑制．以此常溫低氨氮亞硝化反應(yīng)器為對象，分析其功能菌群特性．

2．2亞硝化污泥微觀結(jié)構(gòu)已有研究發(fā)現(xiàn)，Nitrosomonas類AOB數(shù)量較多時能使污泥顏色變黃，這主要是此菌體富含細胞色素所致［15］．亞硝化反應(yīng)器在啟動過程中，就出現(xiàn)污泥顏色變化，由接種時淺黑色逐漸轉(zhuǎn)變成淺黃色，可推測Nitrosomonas類AOB數(shù)量逐漸增多．通過掃描電鏡，對接種污泥與亞硝化污泥進行微觀結(jié)構(gòu)對比分析，結(jié)果如圖3所示．亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）是在污水生物脫氮處理過程中經(jīng)常出現(xiàn)的AOB菌屬，形態(tài)分別為短桿狀或球狀，而NOB主要為硝化桿菌屬（Nitrobacter）與硝化螺菌屬（Nitrospira），對應(yīng)形態(tài)分別為桿狀或螺旋狀．由圖3（a）可知，接種污泥中微生物種類較多，有桿狀菌、短桿菌和球形菌（黑色線圈標注）；而在亞硝化污泥中（圖3（b）），短桿菌、球形細菌較多（黑色線圈標注）．郭建華等［16］曾經(jīng)分析了短程硝化過程中種群結(jié)構(gòu)的演變，SEM結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種污泥中含有桿菌、短桿菌、球形菌以及絲狀菌等多種形態(tài)微生物，而隨著短程硝化的啟動與穩(wěn)定，污泥中短桿菌和球菌數(shù)量增多，成為優(yōu)勢菌群，本實驗亦有類似變化趨勢．為進一步了解反應(yīng)器內(nèi)AOB與NOB豐度，開展污泥的熒光原位雜交（FISH）實驗，分析AOB與NOB的相對比例關(guān)系．

2．3反應(yīng)器功能菌群FISH分析PN反應(yīng)器啟動成功后，亞硝化率接近100％，可推測AOB為優(yōu)勢菌群，NOB得到有效抑制．SEM結(jié)果也表明污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但這都不能直接說明污泥中AOB或NOB數(shù)量的多寡．因此，對接種污泥與亞硝化污泥微生物進行FISH檢測，對其中AOB與NOB分布及相對比例進行定量考察．選取代表性AOB、NOB熒光照片及真細菌熒光照片，通過ImageProPlus6．0軟件進行分析，結(jié)果如圖4所示．圖4（a）和（c）中亮點部分代表AOB（Nitrosomonas）的分布，暗色部分為真細菌．同理，圖4（b）和（d）中亮度高的部分代表NOB（Nitrobacter）的分布，顏色較暗部分為真細菌．對FISH結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，接種污泥中NitrosomonasAOB與NitrobacterNOB的相對比例分別為35％和21％，說明AOB與NOB均是其中優(yōu)勢菌屬，原因是接種污泥是從全程硝化反硝化脫氮污水處理廠中取樣．本實驗中，亞硝化污泥中NitrosomonasAOB相對比例略有升高，為37．3％，而NitrobacterNOB相對比例下降明顯，僅為4．4％，這表明反應(yīng)器中AOB成為優(yōu)勢菌群，而NOB逐漸淘汰．之前有研究發(fā)現(xiàn)，實時控制的SBR小型反應(yīng)器短程硝化運行135d后，AOB數(shù)量占絕對優(yōu)勢，NOB得到抑制與淘洗［16］．Sinha等［17］利用FISH方法，分析了連續(xù)流系統(tǒng)中短程硝化前后的污泥菌群比例，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)器短程硝化的運行，AOB所占比例從接種污泥的2％～3％上升至短程硝化污泥的48％～53％，NOB比例較低，為6％～8％．這些研究表明，反應(yīng)器在不同運行方式及不同控制參數(shù)影響下，AOB及NOB種群結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯變化．本實驗中反應(yīng)器在連續(xù)流運行時間內(nèi)，AOB為優(yōu)勢菌群，NOB活性得到有效抑制，數(shù)量較少.2．4微生物群落結(jié)構(gòu)解析以亞硝化污泥為對象，通過提取基因組DNA、GC338F／907R引物擴增16SrDNA基因、DGGE等步驟，分析微生物群落組成；對DGGE條帶切膠、PCR、克隆測序，獲得的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖5所示．由圖5（a）可知，主要有6類優(yōu)勢菌群存在PN反應(yīng)器內(nèi)，其中條帶3測序結(jié)果與Nitrosomonassp．（HF678378）相似度為96％，表明此類氨氧化菌為PN反應(yīng)器內(nèi)功能菌，負責維持亞硝化過程穩(wěn)定運行．條帶1測序結(jié)果與Blastochlorissp．（AJ401203）相似度為96％．Blastochlorissp．為芽生綠菌屬細菌，革蘭氏染色為陰性，形態(tài)有桿形或卵圓形，異養(yǎng)厭氧生長或者微好氧生長．條帶2與Pseudomonassp．（HE603527）同源性最高，相似度為99％．Pseudomonassp．為假單胞菌屬，為常見的反硝化細菌，此類細菌的存在能夠消耗一部分有機物，這可能與進水中含有少量COD相適應(yīng)．而條帶4與綠彎菌門細菌Chloroflexibacterium（EU875524）相似度為90％，該類細菌為常見的絲狀菌，常在生物脫氮除磷系統(tǒng)中出現(xiàn)［18］，可在活性污泥形成中起到骨架作用，有利于菌膠團的形成．條帶5與α變形綱的食羧寡養(yǎng)菌Oligotrophacarboxidovorans（AB099660）同源性最高，相似度為99％，該菌種也是活性污泥中常見的微生物［19］．而條帶6與δ變形綱的侏囊菌屬細菌Nannocystisaggregans（AJ233945）相似度為95％，后者屬于粘細菌的一種［20］，該類菌為革蘭氏陰性菌，屬于好氧化能有機營養(yǎng)型細菌，難以獲得純培養(yǎng)．綜上，PN反應(yīng)器主要以自養(yǎng)型Nitrosomonassp．功能微生物為主，負責氨氧化過程；此外還存在一些異養(yǎng)菌，如Pseudomonassp．、Chloroflexibacterium及Blastochlorissp．．這些異養(yǎng)菌的存在并沒有影響反應(yīng)器亞硝化效果，推測原因是進水中有機物很少（COD小于50mg／L，BOD5小于15mg／L），異養(yǎng)菌不能大量繁殖.

3結(jié)論

1）通過高氨氮進水與低溶解氧聯(lián)合抑制NOB活性方式，成功啟動亞硝化反應(yīng)器．此后在低基質(zhì)連續(xù)流運行80d內(nèi)，繼續(xù)保持低溶解氧濃度，可使反應(yīng)器出水NO2－－N與NH4＋－N比穩(wěn)定，獲得良好的亞硝化效果．2）PN反應(yīng)器中，亞硝化污泥中以球形菌與短桿菌為主，Nitrosomonas類AOB為優(yōu)勢菌群，相對比例為37．3％，NOB活性被抑制，數(shù)量逐漸減少，相對比例為4．4％．3）對微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析，發(fā)現(xiàn)PN反應(yīng)器存在6類優(yōu)勢微生物，即Blastochlorissp．、Pseudomonassp．、Nitrosomonassp．、Chloroflexibacterium、Oligotrophacarboxidovorans與Nannocystisaggregans，其中Nitrosomonassp．為功能微生物AOB，可與其他微生物和諧共存，維持亞硝化反應(yīng)器穩(wěn)定運行．

作者：曾濤濤 李冬 曾輝平 張昭 李相昆 張杰 單位：污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點實驗室 水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點實驗室 中國建筑科學(xué)研究院建筑設(shè)計院 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室