海水魚腌制過程細菌群落多樣性的探討范文

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摘要:目的揭示海水魚腌制過程細菌群落組成及優勢菌變化規律。方法采用構建16SrDNA基因克隆文庫的分析方法檢測分析不同鹽魚比的海水魚腌制過程中細菌群落多樣性、優勢菌群及其變化規律。結果1∶4和1∶8鹽魚比腌制海水魚前期(5d)優勢菌群都為嗜冷桿菌屬，優勢菌種為養料嗜冷桿菌;1∶4鹽魚比腌制海水魚中期(10d)優勢菌群為嗜冷桿菌屬和假單胞菌屬，優勢菌種為熒光假單胞菌和養料嗜冷桿菌，1∶8鹽魚比腌制海水魚中期(10d)優勢菌群為嗜冷桿菌屬，優勢菌種為養料嗜冷桿菌;2個鹽魚比腌制海水魚中后期(15d)優勢菌群都為嗜冷桿菌屬，優勢菌種為養料嗜冷桿菌;1∶4鹽魚比腌制海水魚后期(20d)優勢菌群為嗜冷桿菌屬，優勢菌種為Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8鹽魚比腌制海水魚后期(20d)優勢菌群為嗜冷桿菌屬，優勢菌種為養料嗜冷桿菌。結論通過16SrDNA克隆文庫分析方法可檢測分析海水魚腌制過程細菌群落多樣性及變化趨勢，對腌制海水魚的質量保持及食用安全具有重要意義。關鍵詞:海水魚腌制;16SrDNA基因克隆文庫;細菌群落多樣性腌制海產品是一種傳統的加工保藏產品，其不僅保存了海產品豐富的營養價值，且具有獨特的口感和風味，深受大眾的喜愛，具有非常廣泛的市場需求［1］。腌制過程是以食鹽為主要輔料，在海產品表面直接撒上適量的固體食鹽(干腌法)或者將海產品浸入食鹽水中(濕腌法)［2］。海產品通過腌制能抑制腐敗菌生長，從而提高食品的防腐性能，延長保質期，改善產品風味。浙江東南沿海地區食用腌制海產品非常普遍，例如咸帶魚、咸黃魚、咸鰳魚等產品［3－5］。海產品腌制過程中作用的細菌菌群種類復雜多樣，有害菌群的大量繁殖會危害人體健康。普通的培養法不能完全反應菌群種類的多樣性，很多菌群無法用傳統培養的方法生長［6］，分子生物學技術突破了傳統方法無法得到微生物純培養的限制，故廣泛應用于不同樣品生態系統中微生物多樣性的調查［7，8］。16SrDNA序列既有保守性，又具有高變性，保守性可以反映生物物種的親緣關系，并給分析系統發育提供了線索，而高變性能則可以表明生物物種的特征核酸序列，并且具有種、屬的結構特征，因此，高變性是生物種屬鑒定的分子基礎［9］。16SrDNA序列分析目前已成為分子鑒定和系統學研究中最具權威性和準確性的檢測方法之一［10］。16SrDNA基因克隆文庫分析方法能較好應用于微生物的分類鑒定和系統發育關系［11］，據文獻報道在土壤微生物系統、海洋微生物系統等環境微生物群落分析上均有應用［12－14］。本文利用分子生物學技術，采用16SrDNA基因克隆文庫分析方法［15］，研究海產品腌制過程中細菌群落的多樣性及其變化，可為腌制海產品的食用安全性、品質控制等提供理論依據。

1材料與方法

1．1材料

海水魚購自中國浙江舟山市農貿市場。

1．2儀器與試劑

MyCyclerPCR儀(美國Bio－Rod公司);GelDocXR凝膠成像系統(美國Bio－Rod公司);Mini－SubCellGT電泳儀(美國Bio－Rod公司);MicrofellR離心機(德國BECKMANCOULTER公司)。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(批號:SK8255);DreamTaq－TMDNA聚合酶(批號:EP0-702);Dntp(批號:D0056);SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(批號:SK8131);SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(批號:SK8191);pMD18－TVector連接試劑盒(批號:D101A);引物由中國上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1．3方法

1．3．1海水魚的腌制

采用傳統干腌法腌制海水魚。將市場購買的海水魚(帶魚和黃魚)洗凈并去除內臟，稱重并放入壇中，以一層魚一層鹽的順序進行放置，鹽魚比分別為1∶4和1∶8。

1．3．2樣品總DNA提取

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，按試劑盒給定步驟，取0d、5d、10d、15d、20d的腌制海水魚制成的1∶10樣品液5ml進行總DNA的提取。

1．3．3PCR擴增

1．3．3．1擴增通用引物

16SrDNA擴增通用引物具體為7F(5'－CAGAGTTTGATCCTGGCT－3')和1540R(5'－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3')。

1．3．3．2PCR擴增反應體系

PCR擴增所用反應體系:10×Buffer(含Mg2+)2．5μl、dNTP(各2．5mmol/L)1μl、DreamTaq－TMDNA聚合酶0．2μl、上游引物及下游引物(10μmol/L)各0．5μl、模板DNA0．5μl，用無菌ddH2O補足25μl體系。

1．3．3．3PCR循環條件PCR反應的循環條件:94℃預變性4min，30個循環(94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃修復延伸10min。

1．3．4純化回收采用1%瓊脂糖電泳，150V、100mA20min電泳觀察。PCR產物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，采用純化試劑盒對目的條帶進行純化回收。

1．3．5克隆測序

按TakarapMD18－TVector連接試劑盒操作將純化后的PCR產物與pMD18－T載體連接，并轉化感受態細胞E．coliJM109。將連接轉化后的菌液涂布在預先用20μl100mmol/LIPTG和100μl20mg/mlX－gal涂布的氨芐青霉素平板上于37℃培養過夜。按SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒操作提取質粒，用引物M13+和M13－進行擴增測序。5個時期共檢測300個陽性克隆。1．4統計學處理測得序列在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，分析出克隆所屬物種的系統位置和與之最近似的種類。

2結果

2．1不同鹽魚比樣品總DNA提取和PCR擴增將1∶4和1∶82個鹽魚比的樣品不同腌制時期(0d、5d、10d、15d、20d)樣品稀釋液提取的總DNA用通用引物進行擴增，PCR擴增產物經電泳檢測如圖1所示。從檢測結果發現，在約1500bp處均出現了熒光條帶，適合16SrDNA克隆文庫的構建。

2．216SrDNA克隆文庫構建

2．2．11∶4鹽魚比腌制過程細菌16SrDNA克隆文庫構建1∶4鹽魚比的海水魚腌制的5個不同時期150個陽性克隆子的測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，150個克隆子與GenBank數據庫中已知細菌的16SrDNA序列相似性為95%～100%。1∶4鹽魚比腌制海水魚不同時期細菌群落測定結果見表1。1∶4鹽魚比腌制海水魚，腌制開始(0d)主要菌屬有芽胞梭菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、金黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬，優勢菌屬為芽胞梭菌屬和假單胞菌屬，其中芽胞梭菌屬占53%，假單胞菌屬占30%，優勢菌屬中的優勢菌種分別為腐化芽胞梭菌和莓實假單胞菌;腌制5d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占77%，芽胞梭菌屬占23%，優勢菌屬中的優勢菌種為養料嗜冷桿菌;腌制10d主要菌屬有假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬，優勢菌屬為假單胞菌屬和嗜冷桿菌屬，其中假單胞菌屬占47%，嗜冷桿菌屬占37%，芽胞梭菌屬占16%，優勢菌屬中的優勢菌種分別為熒光假單胞菌和養料嗜冷桿菌;腌制15d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬、藻青菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占67%，芽胞梭菌屬占30%，優勢菌屬中的優勢菌種依舊為養料嗜冷桿菌;腌制20d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬、藻青菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占77%，芽胞梭菌屬占20%，優勢菌屬中的優勢菌種則發生了變化，由養料嗜冷桿菌變為Psychrobactersp．P2－18(2011)。

2．2．21∶8鹽魚比腌制過程細菌16SrDNA克隆文庫構建1∶8鹽魚比的海水魚腌制的5個不同時期150個陽性克隆子的測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，150個克隆子與GenBank數據庫中已知細菌的16SrDNA序列相似性為92%～100%。1∶8鹽魚比腌制海水魚不同時期細菌群落測定結果見表2。1∶8鹽魚比腌制海水魚，腌制開始(0d)主要菌屬有芽胞梭菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、紫色桿菌屬，優勢菌屬為芽胞梭菌屬，占83%，其他菌屬占17%，優勢菌屬中的優勢菌種為解朊梭菌;腌制5d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬，芽胞八疊球菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占70%，假單胞菌屬和芽胞八疊球菌屬分別占17%和13%，優勢菌屬中的優勢菌種為養料嗜冷桿菌;腌制10d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占93%，假單胞菌屬占7%，優勢菌屬中的優勢菌種依舊為養料嗜冷桿菌;腌制15d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬，優勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占90%，其他菌屬占10%，養料嗜冷桿菌在嗜冷桿菌屬中仍然占絕對優勢;腌制20d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、葡萄球菌屬、藻青菌屬，優勢菌屬仍為嗜冷桿菌屬，占77%，葡萄球菌屬占20%，優勢菌屬中的優勢菌種仍然為養料嗜冷桿菌。種，1∶8鹽魚比腌制體系不同時期總共檢測出7個菌屬29個菌種，鹽度高低對腌制體系菌群構成有一定影響，低鹽度的腌制體系菌群構成比高鹽度的腌制體系菌群構成更復雜，細菌種類更多。腌制前期(5d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群組成不同，但優勢菌屬和優勢菌種一致，優勢菌屬均為嗜冷桿菌屬，優勢菌種均為養料嗜冷桿菌。

腌制中期(10d)，1∶8鹽魚比腌制體系的菌群組成比1∶4鹽魚比腌制體系的菌群組成少了芽胞梭菌屬，1∶4鹽魚比腌制體系的優勢菌屬除了嗜冷桿菌屬外增加了假單胞菌屬，而1∶8鹽魚比腌制體系的優勢菌屬只有嗜冷桿菌屬，兩者有相同優勢菌屬嗜冷桿菌屬和相同的優勢菌種養料嗜冷桿菌，且養料嗜冷桿菌的占比較前一時期有所增加。腌制中后期(15d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群組成依然不同，但優勢菌屬和優勢菌種一致均為嗜冷桿菌屬和養料嗜冷桿菌，且優勢菌種養料嗜冷桿菌的占比都繼續增加。腌制后期(20d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群都由3個菌屬組成，其中2個菌屬相同，只有1個菌屬不同，而優勢菌屬都相同為嗜冷桿菌屬，優勢菌種有所不同，1∶4鹽魚比腌制體系的優勢菌種為Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8鹽魚比腌制體系的優勢菌種依然為養料嗜冷桿菌，且養料嗜冷桿菌的占比較上一時期都有所下降。上述表明，不同鹽度對海水魚腌制過程中的菌群構成有所影響，但不影響優勢菌屬及菌群的動態變化趨勢，優勢菌屬嗜冷桿菌屬在不同鹽度的腌制過程中均占優勢地位，且優勢菌種養料嗜冷桿菌的變化趨勢相同。上述研究表明，16SrDNA克隆文庫分析方法可以較好分析海水魚腌制過程中細菌群落結構，菌群變化規律，一定程度上打破傳統培養方法檢測的局限性［16－17］。通過分析細菌群落多樣性及變化趨勢對腌制海水魚的質量保持及食用安全具有重要意義。

作者：孫瑛；王萍亞；黃朱梁；彭志蘭；崔潔 單位：舟山市食品藥品檢驗檢測研究院