風疹病毒多表位診斷抗原的制備范文

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《病毒學報》2016年第三期

摘要：

原核表達與層析純化獲取風疹病毒多表位診斷抗原，并初步評價其抗原性。將RV衣殼蛋白Caa3～29、aa96～123以及包膜糖蛋白E1aa208～247三個主要免疫顯性表位串聯，密碼子優化后全基因合成；利用基因重組技術將多表位串聯片段插入帶有GST標簽的表達質粒中，在大腸桿菌中進行表達，并利用親和層析和離子交換層析純化目的蛋白；利用WesternBlot（WB）技術對目的蛋白抗原性進行鑒定，并建立RV－IgM抗體檢測ELISA技術，初步評價此方法對陰陽血清樣本的鑒別能力。獲取高度均質的RV多表位診斷抗原，WB實驗表明目的蛋白不但可以被anti－GST單克隆抗體識別，還可以被anti－RV多克隆抗體、RV－IgM陽性血清相應抗體所識別。分別對48份RV急性感染病例的陽性血清、陰性血清和健康人血清進行檢測，發現一致性優異。原核表達與層析純化可以獲取抗原性良好的RV多表位診斷抗原，偶聯HRP后可以作為檢測抗原應用于RV－IgMELISA血清學檢測中。

關鍵詞：

多表位抗原；風疹病毒；原核表達；層析純化；GST標簽

風疹病毒（是風疹的病原體，屬于披膜病毒科風疹病毒屬，為有包膜正義單鏈RNA病毒，人是唯一宿主。RV只有一個血清型，但有多個基因型，目前共有12個被認可的基因型（1B，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1I，1J，2A，2B，2C）和一個臨時基因型（1a）正在或曾在世界各地流行［1］。近年來我國RV的流行是由1E和2B基因型共循環引起的多個傳播鏈所致，其中1E基因型為優勢型別［2］。RV感染成人一般為自限性疾病，但是孕婦感染，尤其是妊娠前三個月的新發感染將會引發流產、死產或胎兒感染后先天性風疹綜合征［3］。鑒于RV的新近感染或急性感染診斷對預防新生兒風疹意義重大，我國已經將RV感染檢測作為孕期檢測的一項重要內容。臨床上通過檢測孕婦血清RV－IgM抗體以確定新近感染或急性感染，但目前國內檢測人血清RV－IgM抗體診斷試劑盒參次不齊，需要進一步優化。一般來說，新發RV感染的血清學診斷依賴于RV－IgM抗體的檢測或者恢復期病人血清IgG抗體水平四倍升高。RV感染的體液免疫應答始于低親和力IgM抗體的產生，隨后抗體類型轉換導致親和力高、免疫效應強的抗體型別產生而消除入侵的病原體。其中補體決定區的體細胞超突變將導致親和力逐漸增強的抗體產生。抗體親和力檢測也常被用于新發感染與過往感染的區分，但尿素等解離劑打開不同親和力抗體與抗原的結合程度無法準確把握。因此RV－IgM抗體的檢測結果作為臨床輔助診斷相對比較客觀。RV三個結構蛋白（衣殼蛋白C、兩個跨膜糖蛋白E1和E2）均可引發抗體應答，但只有E1蛋白為免疫顯性的［4］。免疫沉淀和免疫印跡技術也證實大部分抗RV抗體應答主要由E1蛋白誘發，而且血凝素活性和病毒中和活性都歸于E1蛋白的aa208～239，aa213～239，aa214～240［5］。E1aa208～239已被證實是病毒的主要中和表位［6］，并且作為一種多肽診斷抗原構建的ELISA檢測方法可以與傳統RV檢測ELISA、血凝素凝集實驗以及病毒中和滴定法相媲美［7］。而且這個表位在不同RV株之間是保守的，已被推薦用來測定保護性免疫ELISA檢測指標［7，8］，因此RV診斷抗原中必須包含這個表位。同時E2和衣殼蛋白C也同樣能引發機體免疫應答，已經鑒定出E2糖蛋白上一個B細胞表位aa31～105，衣殼蛋白C上兩個B細胞表位aa1～30和aa96～123［9］。考慮到衣殼蛋白C在病毒顆粒中的含量以及在病毒生命周期中的重要作用，我們在構建表位依賴性診斷抗原時也同時加入衣殼蛋白C上的兩個B細胞表位。谷胱甘肽S－轉移酶基因融合表達系統具有蛋白表達、純化和檢測多種用途。氨基端融合日本血吸蟲GST的蛋白很早就被證實可以在大腸桿菌（E．coli）中可溶性、高水平的表達［10］。GST自身在E．coli中表達可以自發折疊成具有天然構象的具有酶活性的26kDa蛋白質。擁有GST的全部氨基酸序列的融合蛋白也被證實具有GST酶活性［11］。而且細菌裂解物中的GST融合蛋白利用Glutathione親和層析介質很容易純化。本實驗中我們將RV多表位抗原插入到GST表達載體中，使其可以表達出GST－RV融合蛋白，一是避免過多的酶偶聯到抗原表位上產生空間位阻效應而將抗原位點封閉，二是使融合蛋白可以在E．coli中高效可溶性表達。同時在融合蛋白的羧基端我們添加了His標簽，可以利用更加便宜的親和介質進行目的蛋白的純化，大大降低了蛋白純化的成本。本研究利用原核表達系統和層析純化技術獲取的RV串聯表位診斷抗原建立RV－IgM抗體捕獲法ELISA，來鑒定RV的新近感染或急性感染。

一、材料與方法

1主要材料與試劑E．coliBL21（DE3）和GST載體為科室現存，限制性內切酶NcoI和XhoI以及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司。

2基因合成根據大腸桿菌密碼子偏好表，對多表位串聯片段基因序列進行優化（圖1），并在其5’端引入NcoI酶切位點，3’端引入XhoI酶切位點，交由大連寶生物公司合成，基因片段大小為314bp，命名為H29F。

3表達質粒的構建基因片段H29F人工合成后存于pMD－19T載體上，用限制性內切酶NcoI和XhoI將目的片段酶切下來，連接到相同酶切處理的GST表達載體（本科室構建，圖1）上，轉化E．coliBL21（DE3）感受態細胞。次日挑取單克隆菌落進行培養與小量表達，提取陽性克隆質粒進行測序和雙酶切鑒定。鑒定正確的質粒命名為H29。4目的蛋白的表達和純化將新鮮轉化H29質粒的E．coliBL21（DE3）接種于含氨芐霉素（50μg／mL）的LB培養基（10g／L蛋白胨，5g／L酵母提取液，10g／LNaCl）中，32℃振蕩培養16h后等倍擴菌。37℃繼續培養2h后將溫度調至35℃，IPTG終濃度1mmol／L誘導4h后離心收菌（3000g，10min，4℃）。用溶液I（10mmol／LTris–HCl，0．5％TritonX－100，pH8．0）重懸菌體沉淀后超聲破碎（300w－20s－20s－30次），離心（174000g，10min，4℃）收集上清。上清中加入終濃度為500mmol／L的NaCl后上樣于用溶液II（10mmol／LTris–HCl，500mmol／LNaCl，pH8．0）平衡的ChelatingSepharoseFastFlow層析介質中。待上樣完畢，用0mmol／L，30mmol／L，60mmol／L，300mmol／L咪唑（溶于溶液II中）進行梯度洗脫，并收集相應洗脫液。分別取樣SDS－PAGE電泳觀察目的蛋白的含量以及分布情況，將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于基液III（10mmol／LTris–HCl，pH8．0）中進行徹底透析備用。DEAESeph－aroseFastFlow層析介質用基液II平衡后將透析液上樣，待上樣完畢，用0mmol／L，100mmol／L，200mmol／L，400mmol／LNaCl（溶于基液III中）進行梯度洗脫并收集相應洗脫液。分別取樣SDS－PAGE電泳觀察目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于PBS（137mMNaCl，2．7mMKCl，10mM的Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7．4）中徹底透析后，于4℃保存備用。5目的蛋白的鑒定利用WesternBlotting技術對H29抗原性進行鑒定。10μlH29蛋白溶液以及10μlGST標簽蛋白溶液（本實驗室預制）上樣13．5％SDS－PAGE進行電泳（恒流40mA，50min），而后半干轉膜至硝酸纖維素膜（NC）（恒壓15V，30min）上。轉膜完成后，NC膜用封閉液（含5％脫脂奶粉的PBST）于4℃處理過夜。次日分別加入封閉液稀釋的Goatanti－Rubellapolyclonalantibody（12000；MerckMillipore）、Mouseanti－GSTmonoclonalantibody（12000；MerckMilli－pore）、RV－IgM陽性血清（120）、RV－IgM陰性血清（120），常溫孵育1h后用PBST洗膜5次。檢•250•病毒學報32卷測抗體對應為Rabbitanti－GoatIgG－HRPconju－gate（14000；MerckMillipore）、Goatanti－MouseIgG－HRPconjugate（14000；MerckMillipore）和Goatanti－humanIgM－HRPconjugate（14000；MerckMillipore），常溫孵育1h后PBST洗膜5次，最后DAB顯色，清水終止顯色。6H29－HRP偶聯反應IgM抗體捕獲法ELISA構建中，檢測抗原被設計為H29－HRP偶聯物。H29－HRP偶聯反應按照試劑盒操作步驟操作（KPL，MD，USA）。簡言之，純化的H29去內毒素處理后，在HRPconjugationbuffer中透析，透析完成后將終濃度調整為2．0mg／ml。然后逐滴加入合適體積的SureLINKTMActivatedHRP（HRPH29≈2．51）。緩慢攪拌下，4℃孵育過夜。向溶液中加入10μlReducingAgent（NaCNBH3），室溫孵育15min終止反應。最后加等體積2×HRPStorageBuffer，室溫孵育15min后，4℃保存備用。利用棋盤法滴定anti－GSTmonoclonalanti－body和H29－HRP評價偶聯反應效率。用碳酸鹽包被緩沖液二倍系列稀釋Mouseanti－GSTmono－clonalantibody（1250～116000），每個微孔板中加入100μl后，37℃孵育2h。用PBS洗滌3次后，每孔加入200μl封閉液封閉包被孔中的非特異蛋白結合位點。37℃孵育1h后，PBS洗滌3次。然后，用PBS二倍系列稀釋H29－HRP（1250～116000），每孔加入100μl后，37℃孵育1h。PBS洗滌5次后每孔加入50μlTMB（MP，CA，USA）孵育10min。最后加入50μlH2SO4（1mol／L）終止反應。參考基線波長為620nm，用酶標儀測定450nm波長吸收度值（OD值）。7目的蛋白診斷效能的評價利用H29－HRP建立血清RV－IgM抗體診斷ELISA試劑盒，并對臨床和實驗室確診的血清樣本進行檢測，評價試劑盒對陰陽性血清標本的鑒別能力。簡言之，碳酸鹽包被緩沖液稀釋抗μ－二抗（1500）后包被板條孔，封閉液封閉非特異性位點；加入待測血清（1：10稀釋），置37℃孵育1h，然后洗滌；加入H29－HRP偶聯物（11000稀釋），置37℃孵育1h，然后洗滌；加入TMB顯色，參考基線波長為620nm，用酶標儀測定波長為450nm吸收度值（OD值）。

二、結果

1目的蛋白的構建與表達純化H29的構建如圖1，融合蛋白的氨基端為GST標簽，緊跟著衣殼蛋白兩個抗原表位（aa3～29和aa96～123），然后是E1aa208～247抗原表位，羧基端為His標簽，間隔中添加了必要的連接臂（如GGGS等）以及合適的酶切位點（如NdeI、NcoI和XhoI）。雙酶切處理（NcoI和XhoI）GST表達載體和H29F－pMD－19T獲取帶有相同粘性末端的載體（大約6170bp；圖2A）和H29片段（約314bp；圖2B），經過連接酶連接轉化入E．coliBL21（DE3）感受態細胞后進行培養，測序、小量表達（圖3A）和雙酶切鑒定結果（圖2C）證實目的片段已經成功插入表達質粒中，并將正確質粒命名為H29質粒。挑取6個新鮮轉化H29質粒的E．coliBL21（DE3）單克隆菌落培養適當時間后進行誘導表達，SDS－PAGE電泳結構發現，與對照組相比，在約37kDa處有明顯表達條帶（圖3A），表明H29蛋白可以在大腸桿菌中有效表達。大量表達后發現目的蛋白主要存在于超聲菌體沉淀重懸液的上清中（圖3B），目的蛋白含量達到34．17％。將上清液進行處理后利用His親和層析進行純化，電泳結果發現，目的蛋白主要存在于300mmol／L咪唑洗脫液中（圖3B），并且目的蛋白含量達到了92．21％，濃度為2．2mg／mL。300mmol／L咪唑洗脫液經過完全透析后，上DEAE陰離子交換層析柱，電泳結果發現目的蛋白主要分布于200mmol／LNaCl洗脫液中，并且目的蛋白的含量達到了94．86％，濃度為2．1mg／mL（圖3B）。最后將200mmol／LNaCl洗脫液在PBS中進行透析，4℃保存備用。2目的蛋白的鑒定根據目的蛋白中包含GST、RV表位等特征，對H29蛋白的抗原性進行初步鑒定。WesternBlot結果顯示，利用羊抗RV多克隆抗體、鼠抗GST標簽抗體以及RV－IgM陽性血清作為捕獲抗體，其相應二抗作為檢測抗體，在NC膜上相應位置都出現了明顯條帶（圖4）；并且RV－IgM陰性血清作為捕獲抗體，在NC膜上相應位置沒有出現對應條帶。表明了H29蛋白包含了RV抗原表位和GST標簽。3目的蛋白診斷效能的評價通過棋盤滴定法確定H29－HRP最適工作濃度為11000，并且表明H29和HRP已經成功偶聯，可以應用于RV－IGM抗體檢測ELISA試劑盒的建立。利用H29－HRP偶聯蛋白作為診斷抗原建立RV－IgM抗體檢測ELISA試劑盒，分別對48份陽性血清、陰性血清和健康人群血清樣本進行檢測（表1）。從圖5可得出，陽性血清樣本、陰性血清樣本以及健康人群血清樣本A值分布范圍分別為1．60（1．21～1．76，95％置信區間）、0．34（0．25～0．49）和0．23（0．17～0．37）。以陰性結果平均數的2．1倍粗略估算ELISA試劑盒的cutoff值為0．5985，得出其靈敏度為95．84％，特異性為91．67％。并且陽性血清樣本與陰性血清樣本和健康人群血清樣本A值分布明顯不同（P＜0．05），而陰性血清樣本與健康人群血清樣本A值分布無明顯區別（P＞0．05）。對表1數據進行卡方檢驗，我們發現，其χ2＝2．5，P＝0．1138＞0．05，說明ELISA診斷結果與臨床和實驗室確診結果之間無統計學意義。而且kappa值為0．8485，表明一致性優越。因此，新型RV－IgM抗體診斷試劑盒可以很好地鑒別陰陽性血清樣本。

三、討論

本研究中，我們選擇了RVE1蛋白上已經被用圖5H29抗原診斷效果評價Figure5EvaluationofthediagnosticeffectofH29protein于ELISA檢測的一個重要顯性表位aa208～247，而且添加了衣殼蛋白C的兩個表位aa3～29和aa96～123作為診斷抗原，其目的是提高診斷試劑的靈敏度。雖然與包膜蛋白E相比，在誘發免疫應答產生中和活性方面C蛋白抗原表位處于次要地位，但對于診斷而言C抗原意義也很重要［8，12］。在PeleD等研究中［8］，衣殼蛋白C多肽抗原與RV陽性血清反應的滴度都在11600以上，表明RV陽性血清中存在大量與C蛋白上抗原決定簇可以發生反應的抗體（已排除非特異結合反應的存在），并且通過動物實驗證實C抗原也具有較高的免疫原性，可以誘發強烈的抗體應答。針對目前市場上主要以E蛋白作為診斷抗原的試劑盒出現不同程度漏檢的現象，本研究添加C蛋白上的特異表位，旨在初步探索提高診斷試劑靈敏度的方案。GST作為融合蛋白前綴有效提高H29蛋白在原核表達系統中表達量的同時，也在一定程度上增強了其可溶性表達（圖3B）。WesternBlotting實驗證實了H29攜帶RV病毒的主要免疫顯性表位，并且可以與RV－IgM陽性血清中的相應抗體發生反應，初步證實了其抗原性可以應用于新近感染或急性感染的診斷。另外我們將H29與HRP進行了偶聯，并通過棋盤滴定法評價了偶聯效果以及確定了H29－HRP的最適工作滴度，為成品試劑盒的研發鑒定了基礎。此方法不但通過添加GST前綴有效避免了HRP偶聯帶來的抗原效價降低或失活，還將衣殼蛋白C的兩個B細胞表位納入診斷抗原分子中，同時提高了檢測方法的靈敏度和特異性。雖然H29與HRP偶聯實驗的重復性優異，但是是過GST吸引HRP偶聯還是其他原因避免或者減少診斷抗原表位發生偶聯還待進一步研究。另外，本研究中診斷抗原中保留GST和His標簽，一是為了偶聯反應中減少對RV表位的偶聯反應，二是為了穩定串聯表位在GST表面的有效展示，至于兩個標簽對診斷抗原特異性的影響還需要進一步的研究，據目前許多診斷抗原的研究中大多也攜帶著標簽。并且新建立的IgM診斷試劑是以捕獲法ELISA作為基礎研制，已經將標簽的影響降低到了最低。我們利用本實驗室保存的臨床和實驗室診斷確定的陰陽性血清作為血清盤進行抗原診斷能力的評價，尚未按照商品化血清學診斷試劑研發的要求，采用檢定所或其他權威機構建立并提供的系列血清，并就檢測特異性及敏感度與國際上的商品試劑作比較。本研究旨在新型診斷抗原的構建制備、抗原性研究以及其診斷能力的初步探索，實驗將進一步拓展。總之，我們篩選出RV結構蛋白上的抗原表位，并將其串聯在GST標簽的羧基端，讓其在原核表達細胞中進行表達，利用親和層析和離子交換層析成功獲取了帶有GST前綴蛋白和His后綴標簽的診斷抗原，并將其應用于風疹病毒新近感染和急性感染的診斷，證實了H29診斷抗原在ELISA檢測技術中的實用性，很好地解決了RV抗原在偶聯HRP過程中造成的抗原失活或抗原效價降低，有效提高了檢測試劑盒的靈敏度和特異性。

作者：蘇秋東 郭敏卓 邱豐 賈志遠 盧學新 孟慶玲 田瑞光 畢勝利 伊瑤 單位：中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所 北京出入境檢驗檢疫技術中心