瀕危植物珙桐種群遺傳多樣性分析范文

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《西南大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第三期

珙桐DavidiainvolucrateBaill．系珙桐科珙桐屬落葉喬木，中國(guó)特有的單型屬植物，天然分布在我國(guó)的7個(gè)省，即貴州、湖北、湖南、陜西、四川、云南及甘肅［1］．珙桐科僅一種一變種，即珙桐和光葉珙桐DavidiainvolucrateBaill．var．vilmoriniana．它們起源古老，是第三紀(jì)古熱帶植物的孑遺樹種，屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物．珙桐具有極高的觀賞價(jià)值，是世界上公認(rèn)的著名觀賞樹種，開花時(shí)因其棕紅色頭狀花序和潔白的苞片酷似展翅的白鴿，故有“中國(guó)鴿子樹”的美稱．自珙桐被人們發(fā)現(xiàn)之后，被國(guó)內(nèi)外大量引種，目前的分布已遠(yuǎn)遠(yuǎn)跨越其天然保存的范圍，而且引種的趨勢(shì)是逐漸北移和海拔越來越低．但由于人為破壞和環(huán)境因素的影響，天然珙桐的種群數(shù)量和分布范圍都在縮小，張清華等［8］認(rèn)為到2030年，適宜珙桐分布的面積比當(dāng)前氣候條件下適宜珙桐分布的面積約減少20％．珙桐瀕危的原因是多方面的，包括生境范圍狹窄、自然更新困難、種子敗育嚴(yán)重、人為砍伐破壞及挖掘野生苗等［9］．因此，加強(qiáng)珙桐的保護(hù)和研究，合理地開發(fā)和利用具有重要的意義．我國(guó)從20世紀(jì)70年代開始對(duì)珙桐進(jìn)行研究，主要集中在珙桐群落學(xué)、地植物學(xué)、人工繁殖技術(shù)及引種栽培、種群生態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性、組織培養(yǎng)技術(shù)、形態(tài)解剖學(xué)等方面．進(jìn)入21世紀(jì)以來，對(duì)珙桐的研究有了一定的進(jìn)展，主要集中在生理、生化、繁育及分子生物學(xué)等方面，但利用分子標(biāo)記對(duì)不同種群珙桐的遺傳多樣性研究還是相對(duì)缺乏．本文利用ISSR技術(shù)對(duì)分布于貴州省內(nèi)的3個(gè)珙桐自然種群、2個(gè)珙桐人工種群、1個(gè)光葉珙桐人工種群及分布在湖北省內(nèi)的1個(gè)珙桐人工種群的遺傳多樣性、種群內(nèi)和種群間的遺傳變異進(jìn)行分析，旨在揭示珙桐種群的遺傳多樣性和遺傳背景，為瀕危植物珙桐的保護(hù)和合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)．

1材料與方法

1．1供試材料供試材料選取珙桐的6個(gè)種群和光葉珙桐的1個(gè)種群，取其新鮮幼嫩的葉片放在自封袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室置于－80℃冰箱中保存．樣品的來源及編號(hào)見表1．

1．2方法

1．2．1珙桐DNA的提取選用幼嫩葉片，參照改良的CTAB法［22］提取珙桐基因組DNA，DNA濃度和純度用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，波長(zhǎng)260～280nm，OD值在1．8～1．9之間，所提取的DNA純度較高，可用于ISSR擴(kuò)增反應(yīng)．

1．2．2ISSR擴(kuò)增反應(yīng)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的引物參照哥倫比亞大學(xué)公布的引物序列，由北京賽百盛公司合成，在Bio－Rad梯度PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增．ISSR擴(kuò)增反應(yīng)20μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：模板40ng、1．0UTaq酶、10×buffer2．0μL、ISSR引物（10μmol／L）1．2μL、dNTP（2．5mmol／L）2．1μL、MgCl2（25mmol／L）1．8μL、雙蒸水補(bǔ)足至20μL．PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，43．8～57℃（不同引物退火溫度不同）退火45s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min．PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠中含有0．05％的溴化乙錠，以100bpMarkerDNA作為標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄．

1．2．3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性．電泳圖譜中的每一條帶均視為一個(gè)分子標(biāo)記，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)．對(duì)凝膠上的帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按清晰易變、重復(fù)穩(wěn)定的原則讀帶，有帶或弱帶記為1，無帶的記為0，獲得二元數(shù)據(jù)矩陣．用POPGENE軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算各群體間和群體內(nèi)的遺傳參數(shù)．根據(jù)Neis遺傳距離，按不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖．為了檢測(cè)群體間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性，運(yùn)用TFPGA程序進(jìn)行了Mantel測(cè)試．

2結(jié)果與分析

2．1ISSR遺傳多樣性分析從100條引物中篩選出12條能產(chǎn)生條帶清晰、重復(fù)性好的ISSR引物，對(duì)7個(gè)群體的117個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生199條條帶（表2）．圖1顯示引物UBC881對(duì)貴州佛頂山（FDS）的擴(kuò)增結(jié)果．在199條條帶中，有177條具有多態(tài)性，多態(tài)百分率為（PPL）88．94％．每條引物平均產(chǎn)生16．58條條帶，多態(tài)性百分率為85．0％～100％（表2），說明珙桐具有相對(duì)高的多態(tài)性．表3顯示了不同群體的遺傳多樣性結(jié)果，在7個(gè)種群中，佛頂山（FDS）、梵凈山（FJS）、湖北（HB）、寬闊水（KK）、林科院（LKY）、納雍（NY）、植物園（ZWY）的多態(tài)百分率分別是39．20％，47．74％，40．70％，36．18％，48．74％，35．18％，35．68％，其中林科院（LKY）的多態(tài)百分率最高，而納雍（NY）的多態(tài)百分率最低．Neis遺傳多樣性（He）在0．1260～0．1795之間，平均為0．1467．從表3還可以看出，各群體的Shannons信息指數(shù)（Ho）與多態(tài)百分率（PPL）和Neis遺傳多樣性（He）的大小變化趨勢(shì)基本一致，即PPL高的群體其He和Ho也高．此外，還分析了物種水平的遺傳多樣性，在物種水平上PPL為88．94％，Ao，Ae，He和Ho分別為1．8894，1．4813，0．2784和0．4187．

2．2群體間的遺傳變異分析POPGENE軟件的分析結(jié)果顯示，珙桐群體間存在一定的遺傳分化．7個(gè)群體間總的遺傳多樣性（Ht）為0．2793，而群體內(nèi)的遺傳多樣性（Hs）為0．1468．根據(jù)總的遺傳多樣性（Ht）和群體內(nèi)遺傳多樣性（Hs）計(jì)算不同群體間的分化水平（Gst），所分析的7個(gè)珙桐群體間Gst為0．4745，表明總的遺傳變異中有47．45％的變異存在于群體間，群體內(nèi)的遺傳變異為52．55％．群體間每代個(gè)體的基因流（Nm）為0．5537．

2．3群體間的聚類分析計(jì)算Neis遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）（表4），從表4中可見I值的變化范圍為0．7690～0．8681，平均為0．8191；D值變化范圍為0．1415～0．2626，平均為0．2003．其中LKY與FJS的遺傳一致度（I）最高，ZWY與FDS的遺傳一致度最低．利用UPGMA法構(gòu)建群體遺傳關(guān)系聚類圖（圖2），以0．26為閾值，7個(gè)群體分為2支．FDS的單獨(dú)一支，其余6個(gè)聚為一支，表明佛頂山的群體與其余群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)．從圖2中還可看出，F(xiàn)JS，ZWY和LKY聚在一起，表明這幾個(gè)群體的親緣關(guān)系相對(duì)較近．Mantel測(cè)試表明，群體間的遺傳距離與地理距離之間沒有顯著的正相關(guān)性（r＝0．1090，p＝0．5930），說明珙桐的遺傳變異沒有明顯的地域趨勢(shì)．

3討論

3．1珙桐的遺傳多樣性采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)瀕危植物珙桐的6個(gè)種群和1個(gè)光葉珙桐種群進(jìn)行分析，結(jié)果表明珙桐具有豐富的遺傳多樣性．Hamrick等［26］研究了220個(gè)屬662個(gè)種林木中的物種遺傳多樣性平均水平（P＝64．7％，H＝0．257）．王靜等［27］研究了瀕危植物連香樹的遺傳多樣性水平（P＝69．59％，H＝0．2313，I＝0．3514）．葛永奇等［28］研究了孑遺植物銀杏的遺傳多樣性水平（P＝70．45％，H＝0．3599）．與珙桐7個(gè)種群的遺傳多樣性水平（P＝88．94％，H＝0．2784，I＝0．4187）相比，珙桐具有很高的遺傳多樣性水平．瀕危植物珙桐在數(shù)百萬年以前，曾在地球上廣泛分布，經(jīng)過第四紀(jì)冰川的影響，只在我國(guó)西南地區(qū)幸存下來．珙桐遺傳多樣性豐富的原因可能與幸存?zhèn)€體保留了其祖先豐富的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)，使其現(xiàn)存物種具有較高水平的遺傳多樣性．

3．2珙桐群體的遺傳結(jié)構(gòu)群體的遺傳結(jié)構(gòu)是通過物種群體間和群體內(nèi)的遺傳分化來體現(xiàn)［29］．本研究得出珙桐種群間遺傳分化參數(shù)即Neis種群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0．4745，表明有47．45％的遺傳變異存在于種群間，而種群內(nèi)的遺傳變異占總變異的52．55％，表明其種群間發(fā)生了較大程度的遺傳分化．影響自然群體遺傳分化的原因有多種，包括植物的繁育體系、基因突變、種子傳播機(jī)制、自然環(huán)境的選擇作用和基因流等．珙桐7個(gè)種群的基因流（Nm）僅為0．5537．Slatkin認(rèn)為［30］，當(dāng)Nm＜1時(shí)基因流就不足以抵制種群內(nèi)因遺傳漂變而引起的種群分化．由傳粉和種子傳播產(chǎn)生的基因流是導(dǎo)致種群內(nèi)遺傳分化的主要因素之一［31］．珙桐的基因流主要是通過蟲媒傳粉和果實(shí)遷移來實(shí)現(xiàn)的，珙桐基因流不足的原因可能與種子的生物學(xué)特性有關(guān)．珙桐的果實(shí)為核果，呈長(zhǎng)橢圓形，具有肉質(zhì)的果皮，內(nèi)果皮骨質(zhì)，表面有深溝，十分堅(jiān)硬，不易萌發(fā)，種子的散布局限在樹體1～10m環(huán)帶附近［32］；種子休眠期長(zhǎng)，敗育現(xiàn)象嚴(yán)重且具有生理后熟期［16］等，這些原因阻礙了珙桐的自然更新，使種群難以擴(kuò)張，同時(shí)也造成了珙桐群體間較低的基因流動(dòng)．

3．3珙桐的保護(hù)策略珙桐是中國(guó)特有的珍稀瀕危樹種，具有極高的觀賞價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和科研價(jià)值．由于生境范圍狹小、自然更新困難、種子敗育現(xiàn)象嚴(yán)重和人們的肆意破壞等原因，珙桐的自然種群數(shù)量急劇減少．本研究表明珙桐具有豐富的遺傳多樣性，且種群內(nèi)的遺傳變異大于種群間的遺傳變異．為了有效保護(hù)珙桐的遺傳多樣性，建議加強(qiáng)珙桐原產(chǎn)地的就地保護(hù)，同時(shí)人為推廣種子繁殖的方式，達(dá)到盡可能保護(hù)珙桐豐富的遺傳多樣性的目的．

作者：關(guān)萍 張玉晶 石建明 陳業(yè) 單位：貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院