石榴葉多酚的抗氧化活性研究范文
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《南京師大學(xué)報(bào)》2015年第五期
石榴（PunicagranatumL.）別名安石榴、海榴、單若、金罌、天漿等，是石榴科石榴屬植物，為落葉灌木，在我國(guó)分布廣泛，目前全國(guó)石榴栽植面積達(dá)64668hm2，居世界第一位［1］.石榴的葉子具有收斂止瀉、殺蟲(chóng)、治療痘風(fēng)瘡、癩瘡、跌打損傷等一系列功效.雖然石榴葉具有多種生理功能，但其利用率不高，大多數(shù)的石榴葉都作為農(nóng)業(yè)垃圾處理，造成資源的浪費(fèi)［2-4］.據(jù)報(bào)道石榴中含有豐富的安石榴苷、沒(méi)食子酸、鞣花酸、短葉蘇木酚等多酚類化合物［5-8］.該多酚類化合物在抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等方面都顯示了巨大的藥用價(jià)值和潛力［9-12］.但是目前對(duì)石榴葉粗多酚（crudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves，CPPL）的純化研究較少.本研究通過(guò)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)考察了大孔樹(shù)脂對(duì)CPPL的純化效果，并對(duì)其分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步比較了CPPL、石榴葉多酚1（purifiedpolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves1，PPPL1）與石榴葉多酚2（purifiedpolyphenolsofcrudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves2，PPPL2）的抗氧化性.以期為提高石榴葉的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器
1.1.1材料石榴（PunicagranatumL.）葉采于江蘇省南京市鼓樓區(qū)，洗凈烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)60目篩，避光保存?zhèn)溆?大孔樹(shù)脂AB-8、聚酰胺購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司.
1.1.2試劑乙醇、鹽酸、無(wú)水碳酸鈉購(gòu)自南京創(chuàng)化化玻儀器有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Folin-酚試劑購(gòu)自南京榮世德貿(mào)易有限公司；蘆丁（Rutin）標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供.
1.1.3儀器高速萬(wàn)能粉碎機(jī)購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水真空泵購(gòu)自南京科爾儀器設(shè)備有限公司；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎器購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自金壇市杰瑞爾電器有限公司.
1.2石榴葉多酚制備的方法
1.2.1石榴葉多酚的制備CPPL：準(zhǔn)確稱取2g粉末樣品，以20∶1液料比加入50%的乙醇水溶液，超聲破碎后，調(diào)節(jié)pH為2，置水浴鍋水浴1.5h，5000r/min離心10min后過(guò)濾，取一定量的濾液用Folin-Ciocalteu法測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚濃度［13］.PPPL1：將上述CPPL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，過(guò)AB-8得到PPPL1.PPPL2：按文獻(xiàn)［14］的方法將上述PPPL1過(guò)聚酰胺得到PPPL2.
1.2.2石榴葉總酚含量的測(cè)定沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取100mg/L沒(méi)食子酸備用液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL于試管中，依次加入80%乙醇溶液補(bǔ)充至1mL，得到0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列.取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，分別加入2mL0.5mol/LFolin-酚試劑，混勻后在室溫下靜置4min，然后用2mL飽和碳酸鈉中和，室溫條件下在暗處放置2h后用分光光度計(jì)在760nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.0068x+0.0194，R2=0.9954.石榴葉總酚含量的測(cè)定：取一定濃度的樣品溶液0.2mL，后續(xù)步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其濃度，并計(jì)算出總酚含量.
1.3石榴葉多酚純化的工藝條件
1.3.1大孔樹(shù)脂的預(yù)處理將樹(shù)脂用無(wú)水乙醇室溫下密封浸泡8h，水洗至無(wú)醇味，用5%鹽酸溶液浸泡8h，水洗至中性，再用5%NaOH液浸泡8h，水洗至中性，加水備用.
1.3.2大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制稱取抽干大孔吸附樹(shù)脂2g，分別裝入具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的提取溶液50mL，置于振蕩器中（25℃，180r/min）靜態(tài)吸附12h.期間每隔一定時(shí)間用注射器吸取少量溶液，測(cè)定其多酚濃度，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線.將充分吸附后的樹(shù)脂2g用蒸餾水清洗至樹(shù)脂表面無(wú)提取溶液殘留，濾紙吸干樹(shù)脂表面殘留的溶液，然后置于具塞三角瓶中，加入50mL95%乙醇，于相同條件下解吸6h，期間每隔一定時(shí)間用注射器吸取少量溶液，充分解吸后取上清測(cè)定總多酚的濃度，再按如下的公式計(jì)算吸附量、吸附率和解吸量，繪制靜態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)曲線。
1.3.3靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化分別考察提取液多酚質(zhì)量濃度、提取液pH值、上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)及洗脫劑用量對(duì)樹(shù)脂解吸的影響.
1.4石榴葉多酚的抗氧化活性
1.4.1亞硝酸鹽的清除參照王樹(shù)慶等的方法并有所改動(dòng).分別在試管中加入1mL一定梯度的樣品溶液，再分別加入5mL一定濃度的NaNO2溶液，37℃恒溫水浴30min，隨后加入1mL0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置15min后加入0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水3.5mL，混勻，靜置15min，最后于538nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，亞硝酸鹽清除率計(jì)算如下。
1.4.2還原力的測(cè)定參照Seordino等的方法并有所改動(dòng).在2.5mLpH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的樣品溶液1mL，并加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合，50℃恒溫水浴20min，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，5000rpm離心10min，取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，混勻后靜置10min，在700nm處測(cè)定吸光值，以50%的乙醇溶液為空白對(duì)照.
1.4.3超氧陰離子自由基的清除采用鄰苯三酚法，取pH8.2的磷酸緩沖液3mL，分別加入一定體積的樣品溶液，并使用去離子水使反應(yīng)體系補(bǔ)至9mL，混勻，25℃水浴平衡20min.然后加0.6mL7mmol/L的鄰苯三酚，混勻，立即放入分光光度計(jì)中，測(cè)定325nm處的吸光值，記錄反應(yīng)5min后的結(jié)果（測(cè)各樣品時(shí)，以去離子水代替鄰苯三酚作為空白管）.超氧陰離子自由基的清除計(jì)算公式如下。
1.4.4羥自由基的清除采用改良的水楊酸法［29］，分別取1mL不同濃度的多酚或者蘆丁溶液，加入1mL9mmol/LFeSO4，1mL9mmol/L水楊酸-乙酸溶液，最后加入1mL8.8mmol/LH2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為空白對(duì)照，考慮到多酚本身的吸光度值，以加入1mL蒸餾水代替H2O2的反應(yīng)液作為多酚的本底吸收值，在510nm處測(cè)量各濃度的吸光度.
2結(jié)果與分析
2.1石榴葉多酚純化工藝2.1.1AB-8樹(shù)脂吸附及解吸附石榴葉多酚的動(dòng)力學(xué)特性曲線由圖1AB-8吸附動(dòng)力學(xué)可知，0min~200min內(nèi)，隨著吸附時(shí)間的增加，AB-8樹(shù)脂吸附多酚量增加，200min后已經(jīng)基本達(dá)到吸附飽和，說(shuō)明AB-8樹(shù)脂屬于快速平衡型樹(shù)脂.由圖2解吸動(dòng)力學(xué)曲線可知，在80min左右時(shí)，已經(jīng)達(dá)到了最大解吸量.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8樹(shù)脂能快速地達(dá)到吸附平衡和解吸平衡，是富集和洗脫CPPL的理想樹(shù)脂.
2.1.2多酚濃度對(duì)吸附量的影響由圖3可知，CPPL濃度在0.2mg/mL~2.0mg/mL之間，樹(shù)脂的多酚吸附量隨著濃度的增加而迅速增加，濃度為2.0mg/mL~3.5mg/mL時(shí)，吸附量隨濃度增加變化緩慢.由此可得出，提高上樣濃度雖然有利于提高樹(shù)脂的使用效率，但是上樣濃度過(guò)高時(shí)，上樣液易出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，造成樹(shù)脂堵塞，反而降低其吸附能力，因此選定上樣液粗提物濃度為2.5mg/mL較為合適.
2.1.3pH對(duì)吸附量的影響由圖4可知，AB-8對(duì)CPPL的吸附量先升高后下降，在pH=4時(shí)吸附率達(dá)到最大，pH=7時(shí)吸附率最低，其原因可能是上樣液pH的變化可以改變目標(biāo)成分在溶液中存在的形式，影響其溶度，從而影響目標(biāo)成分與大孔吸附樹(shù)脂的分子間作用力.多酚類化合物呈酸性，在微酸性條件下吸附效果較好，因此選pH=4為宜.
2.1.4上樣流速對(duì)吸附效果的影響以流出液累積體積為橫坐標(biāo)，流出液濃度為縱坐標(biāo)作圖，由圖5可知，上樣流速分別為1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min時(shí)，泄漏點(diǎn)分別出現(xiàn)在160mL、130mL、100mL、90mL附近，流速為1mL/min時(shí)，雖然泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的最遲，但因?yàn)榱魉俾瑢?dǎo)致生產(chǎn)周期過(guò)長(zhǎng)、多酚被氧化.綜合考慮后，選擇上樣流速為2mL/min.
2.1.5乙醇濃度對(duì)樹(shù)脂解吸的影響由圖6可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，解吸率先上升后有下降趨勢(shì)，在40%~60%之間時(shí)，解吸率上升幅度較快，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)開(kāi)始下降.因此，從節(jié)約資源的角度考慮選用60%乙醇溶液對(duì)CPPL進(jìn)行洗脫.2.1.6洗脫劑用量的確定由圖7可知洗脫曲線呈高斯分布，表明AB-8樹(shù)脂對(duì)CPPL有很好的洗脫能力.樹(shù)脂上吸附的多酚類物質(zhì)易洗脫，洗脫峰比較集中，當(dāng)洗脫體積為40mL~60mL時(shí)，洗脫液中的多酚含量最高.洗脫劑用量為80mL即1.7BV，CPPL基本被完全洗脫，在此基礎(chǔ)上，再增加洗脫劑用量，解吸量雖有所增加，但增幅很小.因此，從節(jié)約成本出發(fā)，宜以1.7BV~2.0BV左右的洗脫劑用量進(jìn)行洗脫.
2.2石榴葉多酚的抗氧化活性
2.2.1對(duì)亞硝酸鹽的清除作用由圖8可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均對(duì)亞硝酸鹽有較好的清除效果，且隨濃度的增大清除率也隨之增大.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：307.42mg/L、133.95mg/L、102.94mg/L及227.00mg/L.結(jié)果表明：PPPL1和PPPL2對(duì)亞硝酸鹽的清除作用明顯好于Rutin及CPPL，且在相同濃度下PPPL2的清除效果也明顯好于PPPL1.提示隨著石榴葉多酚純度的提高其清除亞硝酸鹽的能力也會(huì)增強(qiáng).
2.2.2還原力的測(cè)定由圖9可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，石榴葉多酚的還原能力與濃度呈一定的量效關(guān)系，還原能力隨多酚的質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng).相同濃度下，4種樣品的還原力為：PPPL2>PPPL1>Rutin>CPPL.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：94.78mg/L、56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.說(shuō)明純化有利于提高石榴葉多酚的還原能力，通過(guò)純化后的石榴葉多酚的還原力強(qiáng)于Rutin.
2.2.3對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用由圖10可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均對(duì)超氧陰離子有較好的清除效果，且隨濃度增大清除率也增大，4種樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力順序?yàn)椋篟utin>PPL2>PPL1>CPPL，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：441.27mg/L、369.70mg/L、255.15mg/L、59.78mg/L.表明石榴葉多酚對(duì)超氧陰離子有一定的清除作用，且經(jīng)分離純化后對(duì)超氧自由基的清除作用得到增強(qiáng).
2.2.4對(duì)羥自由基的清除作用由圖11可知，在0mg/L~25mg/L范圍內(nèi)石榴葉多酚及Rutin對(duì)羥自由基的清除率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系.PPPL2在0mg/L~5mg/L時(shí)就顯示出較強(qiáng)的清除效果，而CPPL在此濃度范圍內(nèi)則幾乎沒(méi)有對(duì)羥自由基起到清除的效果；當(dāng)濃度達(dá)到25mg/L時(shí)，PPPL2、PPPL1及Rutin對(duì)羥自由基的清除率并沒(méi)有明顯的差異.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：22.25mg/L、14.89mg/L、13.07mg/L、9.15mg/L.表明隨著純度的提高，清除羥自由基的效果越好，說(shuō)明石榴葉多酚經(jīng)純化后其生物活性能更好地發(fā)揮出來(lái).
3討論
自由基是人體內(nèi)普遍存在的一類物質(zhì)，主要包括超氧陰離子（O2-•）、羥自由基（•OH）等氧自由基和氮自由基.正常情況下，體內(nèi)存在的防御系統(tǒng)能夠有效清除多余的自由基.但是生活中大氣污染、輻射、吸煙和營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩等問(wèn)題極易使人體內(nèi)自由基增多，從而導(dǎo)致氧化損傷，這將直接或間接地引起蛋白質(zhì)變性、生物膜結(jié)構(gòu)損傷等一系列病變，嚴(yán)重的可造成死亡［30］.另外當(dāng)人體攝入硝酸鹽和可亞硝基化的胺類后會(huì)在體內(nèi)形成N-亞硝胺，只有在體內(nèi)阻斷亞硝胺的前體，才能有效防治癌癥.天然抗氧化劑如多酚類、多糖類、維生素等被廣泛運(yùn)用到食品和化妝品中幫助清除自由基，起到抗氧化作用，并阻斷亞酸胺合成的作用，保障人體健康.因此研究天然高效低毒的抗氧化劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，近些年人們已由原來(lái)研究人工合成抗氧化劑轉(zhuǎn)移到研究從天然植物中篩選抗氧化成分上.本實(shí)驗(yàn)得出石榴葉多酚純化的最佳工藝條件為：AB-8的最佳飽和吸附及解吸時(shí)間為200min和80min，上柱質(zhì)量濃度2.5mg/mL，pH為4，上柱速率2mL/min.由動(dòng)態(tài)解吸附試驗(yàn)又得到最適AB-8的解吸條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，洗脫量1.7BV~2.0BV.在此條件下，CPPL的純度由39.67%提高到62.44%，并采用聚酰胺樹(shù)脂對(duì)PPPL1進(jìn)行分離，得到了純度為92.83%的PPPL2.研究石榴葉多酚的抗氧化作用，得出其對(duì)超氧自由基、羥自由基、亞硝酸鹽的清除率以及還原能力隨著樣品濃度的增加和純度的提高不斷上升.其中PPPL1、PPPL2及Rutin對(duì)亞硝酸鹽的半抑制率分別為：133.95mg/L、102.94mg/L、227.00mg/L，還原力的IC50值分別為56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.由此可以看出PPPL1和PPPL2在還原力及清除亞硝酸鹽能力上比Rutin具有更強(qiáng)的抗氧化效果.因此進(jìn)一步探究提高石榴葉多酚純度的方法和石榴葉多酚抗氧化活性方面的研究將對(duì)石榴葉作為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義.
作者：邢佳 陸文娟 趙云霞 陶明煊 單位：南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院