磷酸鹽還原菌的菌株鑒定范文
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摘要：目的：篩選出磷酸鹽還原菌。方法：將污泥稀釋并采用平板涂布法分離提純磷酸鹽還原菌，選取除磷效果良好的細菌通過顯微鏡觀察進行形態(tài)學鑒定和分子生物學的鑒定。培養(yǎng)得到一株磷酸鹽還原菌YING18并通過細菌形態(tài)、生理生化指標、培養(yǎng)特征和16SrDNA序列進行同源性比較，鑒定該菌株與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的同源性高達99%。
關(guān)鍵詞：磷酸鹽還原菌；菌株純化；菌株鑒定
磷酸鹽還原現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)改變了人們對磷素循環(huán)的認知，磷酸鹽還原工藝以其特有的優(yōu)勢、效能逐漸成為除磷工藝研究的熱點。迄今為止，關(guān)于磷酸鹽還原菌的生長和除磷的特性研究鮮見報道。為探究磷酸鹽還原菌的生長特性和除磷能力，加深對磷酸鹽還原菌的了解，通過以厭氧除磷反應(yīng)機理為理論依據(jù)，采用經(jīng)過磷酸鹽還原菌馴化和富集的厭氧活性污泥作為種泥，使用微生物的分離、提純以及鑒定方法提純出具備磷酸鹽還原功能的細菌，再對分離出的磷酸鹽還原菌進行鑒定，希望為磷酸鹽還原工藝的開發(fā)提效、功能菌群的富集馴化提供理論支持。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試污泥接種污泥取自撫順三寶屯污水處理廠的厭氧池內(nèi)污泥，其含水率為98%，MLSS質(zhì)量濃度和MLVSS質(zhì)量濃度為4.53g/L和2.36g/L，pH為7.4。1.1.2篩選磷酸鹽還原菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)液C6H12O60.9g，Na2PO4•12H2O0.46g，NH4Cl0.76g，微量元素0.3mL配比見表1
1.2試驗方案
1.2.1磷酸鹽還原菌的分離、純化在磷酸鹽還原反應(yīng)器啟動成功后，提取反應(yīng)器中的活性污泥1mL，于無菌三角燒瓶中，加入適量的無菌水及數(shù)粒無菌玻璃珠震蕩搖勻，將污泥震蕩打散，使菌粒均勻分布于溶液中，再利用10倍稀釋法對菌懸液，將菌懸液稀釋至適宜濃度。之后在無菌操作臺中，將稀釋后的菌懸液接種于富磷發(fā)酵培養(yǎng)基，采用平板涂布法使細菌均勻分布于培養(yǎng)基表面，每個濃度3組平行樣，并將平板以保險膜密封，于30℃在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長出后，從菌落分布均勻，數(shù)量適宜的培養(yǎng)皿中挑選具有明顯特征的菌落轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，以達到菌種的分離。如圖1所示。圖1菌種分離1.2.2菌株的純化根據(jù)菌落的外觀和革蘭氏染色的觀察結(jié)果，在超凈工作臺上用接種環(huán)挑取第一代培養(yǎng)基中特征明顯的菌落，觀察菌落外觀和革蘭氏染色結(jié)果，將相同的菌株只保留一個，之后在新的固體培養(yǎng)基的表面進行連續(xù)的劃線操作。重復(fù)劃線4～5次，結(jié)合對菌落的觀察和革蘭氏染色的結(jié)果，共獲得22株純種細菌。如圖2所示。圖2菌種純化1.2.3菌株的富集配制富磷發(fā)酵液體培養(yǎng)基裝于三角燒瓶中，并利用吹氮法排除空氣（O2）于121℃的條件下滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后接種純化后的細菌，放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以達到富集培養(yǎng)的作用，如圖3所示。此程序獲得的細菌用于細菌的生長特性試驗。圖3菌株富集1.2.4菌株的初篩在長出細菌的平板上，對分離純化后的22株細菌進行菌落特征的觀察，記錄細菌的透明度、顏色、邊緣等形態(tài)，以及革蘭氏染色后細菌的形態(tài)。將22株細菌分別接種于含磷發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧管中（PO43--P為10mg/L），如表2所示為分離出的22株細菌的菌落特征及培養(yǎng)3d后各菌株對PO43--P的降解情況由表2可知，所篩選出的22株細菌有以下四種形態(tài)：短桿狀、長桿狀、球狀、鏈桿狀，其中以桿狀為主，菌株之間的菌落形態(tài)差別較大，染色結(jié)果顯示，絕大多數(shù)的細菌是革蘭氏陰性菌。從表2中可以看出，培養(yǎng)3d后，每株細菌都表現(xiàn)出了不同的對PO43--P的去除能力。其中YING6、YG7、YG13、YING18、YING21、YING22，去除率超出20%，具備較良好的除磷能力，因此對以上6株細菌進行磷化氫產(chǎn)氣的試驗。1.2.5磷酸鹽還原菌的復(fù)篩將1.2中挑選出的6株具有良好除磷能力的細菌接種于磷化氫檢測裝置中，表3所示為6株細菌的產(chǎn)氣試驗結(jié)果。由表可知，篩選出的6株細菌其中有YG7、YING18號菌具有產(chǎn)磷化氫氣體的功能。故對以上兩株細菌進行進一步的研究。菌株YG7的菌落特征為：淺白色，微光澤，圓形，點狀小；鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性菌，短桿狀，有芽孢（其形態(tài)見圖4）。菌株YING18的菌落特征為：淺黃色，薄，霧狀，邊緣整齊，勃稠；鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢（其形態(tài)見圖4）。圖4菌落形態(tài)1.2.6生理生化指標鑒定利用《常見細菌系統(tǒng)鑒定》的檢測方法，對細菌的接觸酶、葡萄糖發(fā)酵、醇發(fā)酵、甲基紅、V-P、淀粉水解等指標進行試驗。1.2.7DNA提取、PCR擴增、基因序列對比使用TaKaRa試劑盒，將基因組DNA純化后提取出來備用。試驗方法詳見試劑盒說明書。然后對提取出的DNA進行PCR擴增，其程序為：94℃變性3min；94℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s共30個循環(huán)72℃補充延伸5min；4℃終止保存。所得擴增產(chǎn)物送往北京華大基因公司進行高通量測序。據(jù)所得的16rDNA基因序列，在Genblank數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列的相關(guān)性搜索。
2結(jié)果與分析
2.1菌株的生理生化特征
微生物的生理生化特征是指微生物的代謝產(chǎn)物或需要代謝的物質(zhì)參與化學反應(yīng)而表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象和結(jié)果，通過這些化學反應(yīng)的結(jié)果可以鑒別一些在形態(tài)和其他方面不易區(qū)分的微生物。因此微生物的生理生化特征是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。如表4所示為7、18號細菌的生理生化特性。根據(jù)以上得出的試驗結(jié)果，并查閱《常見細菌系統(tǒng)鑒定》，初步鑒定YG7菌是芽孢桿菌屬，YING18菌是腸桿菌屬。
2.2YING18菌株的基因序列分析
YING18菌株的16rDNA的PCR擴增電泳結(jié)果見圖5，通過與marker-dl2000標準條帶比對，發(fā)現(xiàn)代表菌株的片段長度處于1000~2000，條帶清晰明亮，無雜質(zhì)。圖5PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像圖將測序后的結(jié)果在NCBI上進行Blast對比，得出菌株YING18與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的相似度最高，相似度為99%，確定其為腸桿菌屬，此結(jié)果對應(yīng)第2.1節(jié)中的細菌的生理生化實驗。
3結(jié)語
以污水廠厭氧池污泥為種泥，經(jīng)過分離和多次純化，得到菌落特征不同的純培養(yǎng)物，共計22株。而后對提取出的22株分別進行除磷能力分析，培養(yǎng)3d后，磷酸鹽去除率超過20%的細菌共有6株細菌。對這6株細菌進行磷化氫的檢測試驗，發(fā)現(xiàn)YG7、YING18有磷化氫氣體產(chǎn)生，之后對兩株細菌進行生理生化鑒定初步確定YG7是芽孢桿菌，YING18是腸桿菌。并通過細菌形態(tài)、生理生化指標、培養(yǎng)特征和16SrDNA序列進行同源性比較，鑒定YING18菌株與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的同源性高達99%。
參考文獻：
［1］周康群，劉暉，孫彥富，等.厭氧條件總磷還原為磷化氫種泥篩選及功能菌株鑒定［J］.生態(tài)環(huán)境，2007（06）：1669-1673.
［2］王瑾豐，牛曉君，馬金玲，等.厭氧條件下微生物將磷還原為磷化氫［J］.微生物學通報，2015，42（01）：34-41.
［3］李海云.高鹽度廢水處理中優(yōu)勢耐鹽菌的鑒定及其生長特性初步研究［D］.青島：青島大學，2009.
［4］付玲玲.苯酚降解菌的篩選及其特性的研究［D］.沈陽：東北大學，2009.
［5］陳舒.反硝化聚磷菌的篩選鑒定及其脫氮除磷特性研究［D］.青島：青島大學，2012.
［6］李海云.高鹽度廢水處理中優(yōu)勢耐鹽菌的鑒定及其生長特性初步研究［D］.青島：青島大學，2009.
作者：馬榕徽 單位:沈陽建筑大學