磷酸鹽還原菌的菌株鑒定范文
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摘要：目的：篩選出磷酸鹽還原菌。方法：將污泥稀釋并采用平板涂布法分離提純磷酸鹽還原菌，選取除磷效果良好的細菌通過顯微鏡觀察進行形態學鑒定和分子生物學的鑒定。培養得到一株磷酸鹽還原菌YING18并通過細菌形態、生理生化指標、培養特征和16SrDNA序列進行同源性比較，鑒定該菌株與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的同源性高達99%。
關鍵詞：磷酸鹽還原菌；菌株純化；菌株鑒定
磷酸鹽還原現象的發現改變了人們對磷素循環的認知，磷酸鹽還原工藝以其特有的優勢、效能逐漸成為除磷工藝研究的熱點。迄今為止，關于磷酸鹽還原菌的生長和除磷的特性研究鮮見報道。為探究磷酸鹽還原菌的生長特性和除磷能力，加深對磷酸鹽還原菌的了解，通過以厭氧除磷反應機理為理論依據，采用經過磷酸鹽還原菌馴化和富集的厭氧活性污泥作為種泥，使用微生物的分離、提純以及鑒定方法提純出具備磷酸鹽還原功能的細菌，再對分離出的磷酸鹽還原菌進行鑒定，希望為磷酸鹽還原工藝的開發提效、功能菌群的富集馴化提供理論支持。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試污泥接種污泥取自撫順三寶屯污水處理廠的厭氧池內污泥，其含水率為98%，MLSS質量濃度和MLVSS質量濃度為4.53g/L和2.36g/L，pH為7.4。1.1.2篩選磷酸鹽還原菌的基礎培養液C6H12O60.9g，Na2PO4•12H2O0.46g，NH4Cl0.76g，微量元素0.3mL配比見表1
1.2試驗方案
1.2.1磷酸鹽還原菌的分離、純化在磷酸鹽還原反應器啟動成功后，提取反應器中的活性污泥1mL，于無菌三角燒瓶中，加入適量的無菌水及數粒無菌玻璃珠震蕩搖勻，將污泥震蕩打散，使菌粒均勻分布于溶液中，再利用10倍稀釋法對菌懸液，將菌懸液稀釋至適宜濃度。之后在無菌操作臺中，將稀釋后的菌懸液接種于富磷發酵培養基，采用平板涂布法使細菌均勻分布于培養基表面，每個濃度3組平行樣，并將平板以保險膜密封，于30℃在恒溫培養箱培養，待菌落長出后，從菌落分布均勻，數量適宜的培養皿中挑選具有明顯特征的菌落轉接至新的培養基中，以達到菌種的分離。如圖1所示。圖1菌種分離1.2.2菌株的純化根據菌落的外觀和革蘭氏染色的觀察結果，在超凈工作臺上用接種環挑取第一代培養基中特征明顯的菌落，觀察菌落外觀和革蘭氏染色結果，將相同的菌株只保留一個，之后在新的固體培養基的表面進行連續的劃線操作。重復劃線4～5次，結合對菌落的觀察和革蘭氏染色的結果，共獲得22株純種細菌。如圖2所示。圖2菌種純化1.2.3菌株的富集配制富磷發酵液體培養基裝于三角燒瓶中，并利用吹氮法排除空氣（O2）于121℃的條件下滅菌20min，待培養基冷卻至室溫后接種純化后的細菌，放入30℃的恒溫培養箱中培養24h，以達到富集培養的作用，如圖3所示。此程序獲得的細菌用于細菌的生長特性試驗。圖3菌株富集1.2.4菌株的初篩在長出細菌的平板上，對分離純化后的22株細菌進行菌落特征的觀察，記錄細菌的透明度、顏色、邊緣等形態，以及革蘭氏染色后細菌的形態。將22株細菌分別接種于含磷發酵培養基的厭氧管中（PO43--P為10mg/L），如表2所示為分離出的22株細菌的菌落特征及培養3d后各菌株對PO43--P的降解情況由表2可知，所篩選出的22株細菌有以下四種形態：短桿狀、長桿狀、球狀、鏈桿狀，其中以桿狀為主，菌株之間的菌落形態差別較大，染色結果顯示，絕大多數的細菌是革蘭氏陰性菌。從表2中可以看出，培養3d后，每株細菌都表現出了不同的對PO43--P的去除能力。其中YING6、YG7、YG13、YING18、YING21、YING22，去除率超出20%，具備較良好的除磷能力，因此對以上6株細菌進行磷化氫產氣的試驗。1.2.5磷酸鹽還原菌的復篩將1.2中挑選出的6株具有良好除磷能力的細菌接種于磷化氫檢測裝置中，表3所示為6株細菌的產氣試驗結果。由表可知，篩選出的6株細菌其中有YG7、YING18號菌具有產磷化氫氣體的功能。故對以上兩株細菌進行進一步的研究。菌株YG7的菌落特征為：淺白色，微光澤，圓形，點狀??；鏡檢結果為革蘭氏陽性菌，短桿狀，有芽孢（其形態見圖4）。菌株YING18的菌落特征為：淺黃色，薄，霧狀，邊緣整齊，勃稠；鏡檢結果為革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢（其形態見圖4）。圖4菌落形態1.2.6生理生化指標鑒定利用《常見細菌系統鑒定》的檢測方法，對細菌的接觸酶、葡萄糖發酵、醇發酵、甲基紅、V-P、淀粉水解等指標進行試驗。1.2.7DNA提取、PCR擴增、基因序列對比使用TaKaRa試劑盒，將基因組DNA純化后提取出來備用。試驗方法詳見試劑盒說明書。然后對提取出的DNA進行PCR擴增，其程序為：94℃變性3min；94℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s共30個循環72℃補充延伸5min；4℃終止保存。所得擴增產物送往北京華大基因公司進行高通量測序。據所得的16rDNA基因序列，在Genblank數據庫中進行Blast序列的相關性搜索。
2結果與分析
2.1菌株的生理生化特征
微生物的生理生化特征是指微生物的代謝產物或需要代謝的物質參與化學反應而表現出不同的現象和結果，通過這些化學反應的結果可以鑒別一些在形態和其他方面不易區分的微生物。因此微生物的生理生化特征是微生物分類鑒定的重要依據之一。如表4所示為7、18號細菌的生理生化特性。根據以上得出的試驗結果，并查閱《常見細菌系統鑒定》，初步鑒定YG7菌是芽孢桿菌屬，YING18菌是腸桿菌屬。
2.2YING18菌株的基因序列分析
YING18菌株的16rDNA的PCR擴增電泳結果見圖5，通過與marker-dl2000標準條帶比對，發現代表菌株的片段長度處于1000~2000，條帶清晰明亮，無雜質。圖5PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳成像圖將測序后的結果在NCBI上進行Blast對比，得出菌株YING18與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的相似度最高，相似度為99%，確定其為腸桿菌屬，此結果對應第2.1節中的細菌的生理生化實驗。
3結語
以污水廠厭氧池污泥為種泥，經過分離和多次純化，得到菌落特征不同的純培養物，共計22株。而后對提取出的22株分別進行除磷能力分析，培養3d后，磷酸鹽去除率超過20%的細菌共有6株細菌。對這6株細菌進行磷化氫的檢測試驗，發現YG7、YING18有磷化氫氣體產生，之后對兩株細菌進行生理生化鑒定初步確定YG7是芽孢桿菌，YING18是腸桿菌。并通過細菌形態、生理生化指標、培養特征和16SrDNA序列進行同源性比較，鑒定YING18菌株與登錄號為Enterobactersp.KC736654.1的同源性高達99%。
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作者：馬榕徽 單位:沈陽建筑大學