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1實驗方法

1.1菌株活化配制CPDA培養基，接種香菇南山1號菌株，28℃培養，待菌株滿管后，4℃冰箱保藏備用。

1.2液體母種的制備配制母種培養基，取香菇南山1號0.5cm2菌塊接種于母種培養基中，靜置24h，28℃、170r/min振蕩培養10d備用。

1.3生物轉化量的測定將液體條件下培養好的香菇菌絲體抽濾至不滴水，電子分析天平稱重。

1.4單因素試驗碳源篩選試驗：在碳源篩選培養基中，用10.0g玉米粉分別與麥芽糖、紅糖、蔗糖和葡萄糖各20.0g組合作為碳源，配制培養基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養10d，每種培養基3個重復，測定菌絲生物轉化量，求平均值，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳碳源組合作為Plackett-Burman設計考慮因素。氮源篩選試驗：在氮源篩選培養基中，用10.0g麥麩分別與酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0g組合作為氮源，配制培養基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養10d，每種培養基3個重復，測定菌絲生物轉化量，求平均值，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳氮源組合作為Plackett-Burman設計考慮因素。

1.5Plackett-Burman設計試驗根據單因素試驗結果，選取11個因素(紅糖、玉米粉、麥麩、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4•7H2O、VB1、初始pH、接種量、溫度、振蕩速度)作為研究對象，進行Plackett-Burman設計試驗，按照表4和表5配制培養基，接液體母種，靜置24h，振蕩培養10d，每組試驗設3個重復，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉化量，求平均值，借助Minitab15軟件對數據進行統計分析。

1.6最陡爬坡試驗根據Plackett-Burman試驗結果，以及各個顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向進行試驗。針對影響顯著因素進行最陡爬坡試驗，將正效應的值逐步增加，負效應的值逐步減小，設計試驗找出峰值，以尋找快速最佳的響應區域。每種培養基設3個重復，接種后靜置24h，振蕩培養10d，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉化量。

1.7Box-Behnken試驗設計與分析根據上述試驗，以菌絲生物轉化量為響應值，采用玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計，因素與水平編碼見表1。

1.8數據處理與分析采用Minitab15軟件和Excel數據分析工具中的t−檢驗(雙樣本異方差假設)對Plackett-Burman試驗結果進行分析，并采用Design-Expert8.0.6軟件對Box-Behnken試驗結果進行分析。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同碳源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行試驗，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，結果見表2。表2結果表明，不同碳源對香菇菌絲體生長的生物轉化量不同，其中以紅糖和玉米粉組合最好，菌絲生物轉化量最高。以麥芽糖和玉米粉組合也顯現出較高的生物轉化量，葡萄糖和玉米粉組合的菌絲生物轉化量最低。根據不同碳源組合培養基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉化量,可確定紅糖與玉米粉組合為最佳碳源，菌絲生物轉化量為27.322g/L。

2.1.2不同氮源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行試驗，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，結果見表3。表3結果表明，不同氮源對香菇菌絲體生長的生物轉化量不同，其中以牛肉粉和麥麩組合最好，菌絲生物轉化量高。以酵母粉和麥麩組合作為氮源也顯現出較高的生物轉化量，NH4NO3和麥麩組合的菌絲生物轉化量最低。根據不同氮源組合培養基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉化量,可確定牛肉粉與麥麩組合為最佳氮源，菌絲生物轉化量為30.343g/L。

2.2Plackett-Burman設計試驗選用試驗次數n=12的Plackett-Burman試驗設計，考察X1(紅糖)、X2(玉米粉)等11個因素，根據前期試驗結果，每個因素取兩水平，以菌絲生物轉化量Y為響應值。同時借助Minitab15軟件對實驗結果進行統計分析，并通過t−檢驗從11個因素中選出了4個最顯著影響因素，結果見表4和表5。表4和表5結果表明，對香菇菌絲生物轉化量影響的顯著因素：玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的時候，菌絲生物轉化量的值明顯增加，為正效應因素。而X6在量增多的時候，菌絲生物轉化量反而降低，因此X6為負效應因素。

2.3最陡爬坡試驗響應面擬合只有在鄰近最大響應區域后才能最好地反映出真實情況，故要先逼近最佳響應區域。根據Plackett-Burman試驗結果，將玉米粉（X2）、麥麩（X3）和接種量（X11）的值逐步增加，MgSO4•7H2O（X6）的值逐步減小。根據Minitab15軟件試驗分析，其他因素取高水平，結果見表6。表6結果表明，在玉米粉24.0g/L，麥麩14.0g/L，MgSO4•7H2O1.1g/L，接種量14.0%時，測得香菇菌絲生物轉化量最大為29.214g/L，所以此為最佳響應區域。

2.4Box-Behnken試驗設計與分析按照表1中因素水平，借助Design-Expert8.0.6軟件進行4因素3水平Box-Behnken試驗設計，結果見表7。

2.5回歸模型方差分析結果經Design-Expert8.0.6軟件，以玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）為響應變量，以菌絲生物轉化量（Y）為響應值對表7結果進行處理，得到表8回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性的二次多項式擬合。

2.6響應面及等高值分析結果根據回歸方程繪制菌絲生物轉化量隨各因素變化的響應曲面圖，由響應曲面圖可知玉米粉、麥麩、MgSO4•7H2O、接種量4個因素對香菇菌絲生物轉化量的影響(圖1、圖2)。每個響應曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用，其余兩個因素保持在編碼水平的0水平。圖1結果顯示，在一定接種量條件下，隨著玉米粉含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較低條件下，隨著接種量的增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較高條件下，接種量對香菇菌絲生物轉化量影響不明顯。圖2結果顯示，在低硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在高硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈下降趨勢；在低麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在高麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈下降趨勢。在實際生產過程中，為了降低成本，盡可能使用有機廉價的原料，所以在“criteria”選項中選擇MgSO4•7H2O為最小值，玉米粉、接種量、麥麩為平均值，香菇菌絲生物轉化量為最大值，利用Design-Expert8.0.6得到香菇南山1號菌株液體種的最優生產工藝條件：玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L，初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min振蕩發酵10d，菌絲生物轉化量擬合值為49.956g/L。

2.7驗證試驗根據最優生產工藝條件參數對模型進行驗證，繼續發酵培養，最終得到香菇菌絲生物轉化量為51.004g/L，在初始培養條件下菌絲生物轉化量為29.214g/L，優化后提高了1.75倍。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。該結果表明，響應面法優化香菇液體種最佳生產工藝條件是可行有效的。

3結論

本試驗在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析法對香菇南山1號菌株液體種生產工藝條件進行了優化，并得到回歸方程，表明玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）對響應值均有顯著影響，接種量和玉米粉、麥麩和MgSO4•7H2O交互作用顯著。經回歸分析并結合生產實際，確定香菇南山1號菌株的液體種生產工藝條件為玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L、初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min搖床發酵10d，此條件下菌絲生物轉化量為51.004g/L，比之前得到大幅度提高。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明該模型可靠性較高，能很好地預測試驗結果。相比現有報道，本研究所得香菇菌絲生物轉化量較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產工藝簡單且成本低，可為香菇南山1號菌株的液體種生產和栽培提供理論參考。

作者：陳文強喬艷明單位：陜西理工學院生物科學與工程學院陜西省食藥用菌工程技術研究中心