多糖的藥代動(dòng)力學(xué)研究范文

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1生物樣品中多糖的分析檢測(cè)方法

1.1放射性同位素標(biāo)記法多糖經(jīng)放射性同位素標(biāo)記后,在生物樣品中產(chǎn)生的放射性強(qiáng)弱可間接表征其濃度高低,并通過X線膠片或儲(chǔ)存磷光屏感光可反映多糖在體內(nèi)的分布情況,操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)迅速。常用的放射性同位素有125I、124I、14C、3H、2H和99Tcm等。經(jīng)3H標(biāo)記的甘露聚糖通過灌胃或腹腔注射給藥后,可采用液體閃爍記數(shù)儀測(cè)定其在小鼠血液、組織、尿液和糞便中含量變化,結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體切片放射性自顯影可測(cè)定多糖在各臟器的分布。2H標(biāo)記的殼聚糖棒經(jīng)手術(shù)植入大鼠脛骨中,通過局部組織的放射性動(dòng)態(tài)變化可測(cè)算殼多糖的吸收情況。此外,放射性標(biāo)記法還用于分析測(cè)定鏈球菌肽聚糖經(jīng)腹腔注射后在大鼠體內(nèi)的降解和保留,以及透明質(zhì)烷在大鼠和狗體內(nèi)的吸收、分布和排泄。特別地,Lendvai等采用同位素標(biāo)記法探討了新型隱球菌多糖在小鼠體內(nèi)分布的相關(guān)免疫機(jī)制。然而,同位素標(biāo)記法分析多糖的量變及分布時(shí),各組織的總放射性并不完全等同于組織中實(shí)際的多糖含量,還應(yīng)考慮機(jī)體內(nèi)降解作用對(duì)測(cè)定真實(shí)性的影響,可結(jié)合其他方法識(shí)別降解產(chǎn)物及其放射性加以矯正。

1.2分光光度法分光光度法測(cè)定多糖常采用的顯色劑有活性艷紅3B-A、天青A和1,9-二甲基亞甲藍(lán)?；钚云G紅3B-A與氨基多糖的反應(yīng)絡(luò)合物在波長(zhǎng)575nm處有特征吸收,可實(shí)現(xiàn)比色定量,在5～80μg•mL1濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。探針天青A可以通過靜電作用與大鼠血漿中茯苓硫酸酯化多糖結(jié)合,在相鄰分子蒽狀雜環(huán)之間發(fā)生共軛偶合,定向聚集產(chǎn)生變色效應(yīng),且620nm處吸收度在1～10μg•mL1濃度內(nèi)呈現(xiàn)負(fù)線性相關(guān)。相似的,基于硫化多糖與1,9-二甲基亞甲藍(lán)結(jié)合的比色法也能有效測(cè)定多糖在大鼠血液和尿液中的濃度,但該染色法并不適合正常哺乳動(dòng)物尿液中葡萄糖胺聚糖的定量檢測(cè),因?yàn)槟蛞褐械钠渌头肿恿砍煞謺?huì)干擾染色使測(cè)定結(jié)果偏高。

1.3熒光光度法Polymer-H是熒光標(biāo)記的合成聚合物,能特異結(jié)合硫化多糖,且熒光強(qiáng)度與多糖濃度(0.63～5.0μg•mL1)存在顯著的劑量依賴關(guān)系。在葡聚糖的還原性末端共價(jià)結(jié)合二氨基丙烷(DAP),再將分子探針AlexaFluor488結(jié)合到DAP上生成熒光標(biāo)記產(chǎn)物,可測(cè)定在大鼠體內(nèi)的多糖。此外,FITC標(biāo)記殼聚糖的熒光強(qiáng)度在0.125～4.00μg•mL1線性良好。

1.4生物測(cè)定方法經(jīng)(1→3)-β-D-葡聚糖活化的凝血因子G能激活凝固酶原,使之轉(zhuǎn)化為凝固酶而產(chǎn)生凝集反應(yīng),鱟三肽被凝固酶水解釋放出對(duì)硝基苯胺(PNA)在溶液中呈黃色,再加入偶氮試劑生成玫紅色產(chǎn)物可以比色定量,而生成的PNA量與(1→3)-β-D-葡聚糖濃度成正比。采用鱟試劑凝集反應(yīng)測(cè)定比格犬和大鼠血清中香菇多糖濃度,在5～200ng•mL1內(nèi)線性關(guān)系良好。此外,通過該法也能測(cè)定靜脈注射后兔血清中白色念珠菌(1→3)-β-D-葡聚糖的含量的量效關(guān)系(r=0.985),由此可通過NO釋放間接測(cè)算樣品中多糖濃度。

1.5其他方法陳地靈等采用苯酚硫酸法測(cè)定巴戟多糖經(jīng)大鼠在體小腸灌注吸收后的濃度變化,并利用酚紅在小腸內(nèi)基本不吸收的原理,通過酚紅濃度變化對(duì)灌流液體積進(jìn)行校正,消除體積變化對(duì)多糖濃度的影響。將茶多糖和當(dāng)歸多糖制備為多糖鐵復(fù)合物,可通過比色法或原子吸收法測(cè)定鐵的含量來(lái)反映多糖濃度,但結(jié)果易受復(fù)合物解離的影響波動(dòng)較大。

2多糖的藥代動(dòng)力學(xué)研究概況

2.1血藥濃度活性多糖給藥后的血藥濃度時(shí)間曲線大多數(shù)符合二室模型,如靜脈注射于大鼠的麥冬多糖;灌胃于大鼠和靜脈注射于家兔的硫酸多糖916;靜脈注射于比格犬、小鼠和大鼠的香菇多糖及其脂質(zhì)體。白芨多糖靜脈注射后在兔體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)符合三室模型,按一級(jí)速率過程消除,呈線性特征。而在灌胃劑量25～100mg•kg1內(nèi),貽貝多糖MA在大鼠體內(nèi)呈非線性特征。

2.2吸收和分布多糖經(jīng)腸道上皮吸收的途徑包括細(xì)胞旁路和跨細(xì)胞膜,而研究方法主要分為3類。①在體法。如在體全小腸段灌注實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),巴戟多糖的小腸吸收符合Fick’s擴(kuò)散定律,為被動(dòng)擴(kuò)散;六味地黃多糖經(jīng)在體腸灌流后在十二指腸/空腸上段、空腸下段和回腸的吸收率分別為16.5%、6.32%和3.09%,而在大腸中不吸收,其吸收方式可能主要為胞飲作用。②離體法。大鼠外翻腸囊模型證實(shí)黃芪多糖在整個(gè)小腸段均有吸收,且主要以未解離狀態(tài)通過小腸細(xì)胞的胞飲作用攝取;離體組織分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)口灌胃的FITC-氨基多糖微粒先后分布于大鼠胃部和小腸各段,且8h后主要集中在小腸末端。③細(xì)胞模型法。Caco-2細(xì)胞模型能模擬人小腸的生理狀態(tài),應(yīng)用于肉蓯蓉多糖的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究發(fā)現(xiàn),多糖在1.87～40.00mg•L1內(nèi)的Papp(A-B)均小于1×107cm•s1,屬于吸收不良藥物;賈曉燕研究證實(shí),氨基多糖主要黏附于Caco-2細(xì)胞膜邊緣和細(xì)胞間隙,而經(jīng)納米化之后跨細(xì)胞膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的能力顯著增強(qiáng)。多糖在組織器官中的分布可能主要存在兩種作用,即“主動(dòng)”靶向和“被動(dòng)”靶向。其“主動(dòng)”靶向的實(shí)質(zhì)為組織細(xì)胞攝取,主要方式為吞噬和胞飲,且肝臟和脾臟是首要的靶向器官。阿拉伯半乳聚糖和芽霉菌糖可能通過唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的胞吞作用主要分布于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中,而實(shí)質(zhì)細(xì)胞對(duì)125I-葡聚糖的攝取為胞飲作用。葡聚糖在肝臟和脾臟中的分配容積由單核巨噬細(xì)胞、肝臟血小板以及脾臟和腎臟對(duì)多糖的攝取所決定。銀耳多糖經(jīng)靜脈注射后主要通過大鼠肝臟Kupffer細(xì)胞吞噬攝取。除肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞外,肺和脾臟中的吞噬細(xì)胞,以及肝臟上皮細(xì)胞,也能特異性攝取多糖。然而,多糖被攝取前首先要經(jīng)血管轉(zhuǎn)移到組織,因受毛細(xì)血管內(nèi)皮的阻礙可能選擇性分布在毛細(xì)血管有孔或不連續(xù)的組織中,如肝臟、脾臟、骨髓和腎臟,存在靶向被動(dòng)性。肝臟不連續(xù)內(nèi)皮毛細(xì)血管的孔徑約100nm,且孔率達(dá)6%～8%,部分多糖不用與實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面結(jié)合就能進(jìn)入血液循環(huán)。

2.3降解和排泄多糖進(jìn)入機(jī)體后,在內(nèi)源性酶或微生物(酶)的作用下可能發(fā)生一定程度降解。小鼠結(jié)腸中含有大量分解葡聚糖的厭氧菌,相對(duì)分子質(zhì)量44kDa的葡聚糖經(jīng)灌胃12h后,以完全解聚或降解的形式由糞便排出。且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),該葡聚糖在脾臟、腸道、肝臟和腎臟勻漿中少量葡聚糖分解酶的作用下發(fā)生降解。殼聚糖及其高分子降解產(chǎn)物不易經(jīng)外周組織吸收,主要由尿液排出體外。而低分子量殼聚糖及其部分降解產(chǎn)物主要經(jīng)血管轉(zhuǎn)移到外周組織如肝臟,并進(jìn)一步降解為小分子。相對(duì)分子質(zhì)量約460kDa的FITC-羧甲基殼聚糖經(jīng)腹腔注射24h后,在大鼠肝臟中降解至相對(duì)分子質(zhì)量10kDa以下。此外,來(lái)源于A群和D群鏈球菌細(xì)胞壁的肽聚糖多糖(PG-PS)經(jīng)腹腔注射后,均在大鼠血液和關(guān)節(jié)中發(fā)生顯著降解(相比肝臟和脾臟)。甘露葡聚糖經(jīng)灌胃和腹腔注射給藥后,主要通過糞便和尿液排出,其中糞便中含22%原形糖,而尿液中未檢出原形糖。FITC-氨基多糖(AP)腹腔注射到小鼠體內(nèi)24h后,絕大部分通過腎臟和尿液排出。同樣,相對(duì)分子質(zhì)量4.8kDa的麥冬多糖經(jīng)靜脈注射后由大鼠腎臟快速排除,且腎臟中的多糖蓄積量顯著高于其他組織。傷寒沙門菌多糖經(jīng)靜脈注射后,在兔血液中的清除速率呈雙相曲線,可能與多糖的不均一性有關(guān),其中快速清除相為腎臟排除的具有特異抗原特性的組分。

3影響多糖藥代動(dòng)力學(xué)的因素

3.1理化性質(zhì)多糖的理化性質(zhì),包括相對(duì)分子質(zhì)量、電荷和化學(xué)構(gòu)象等,是影響其PK的重要因素。一般而言,小分子多糖通過被動(dòng)擴(kuò)散或載體轉(zhuǎn)運(yùn)吸收;脂多糖通過膜脂擴(kuò)散或淋巴系統(tǒng)吸收;水溶性多糖通過水合孔和(或)細(xì)胞間隙擴(kuò)散,經(jīng)內(nèi)吞或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。多糖進(jìn)入血液循環(huán)后,其消除半衰期及組織器官蓄積量均會(huì)隨相對(duì)分子質(zhì)量的增大而增加,并根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征和電荷性質(zhì)表現(xiàn)出不同的靶向性。此外,腎小球(<10nm)對(duì)多糖的過濾作用不僅與其相對(duì)分子質(zhì)量和電荷性質(zhì)有關(guān),還受其分子形態(tài)和剛性影響。3.1.1相對(duì)分子質(zhì)量臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn),作為抗癌藥物前體的多糖,其相對(duì)分子質(zhì)量大多介于25～50kDa,除了多糖自身的抗癌活性因素外,還與PK有關(guān)。當(dāng)氨基多糖的相對(duì)分子質(zhì)量從213kDa降至10kDa時(shí),A549細(xì)胞對(duì)其攝取率也減少了26%。相對(duì)分子質(zhì)量大的多糖通常表現(xiàn)出較低的清除率和較長(zhǎng)的血漿保留時(shí)間。隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增大(39、73、90kDa),白芨多糖在兔體內(nèi)的t1/2β、MRT0t[n]和MRT0∞均隨之增大。相對(duì)分子質(zhì)量顯著影響外周組織對(duì)腹腔注射殼聚糖的攝取,112.3kDa殼聚糖的分布為腎臟>脾臟>肝臟,而496.2kDa殼聚糖的分布為脾臟>腎臟>肝臟。對(duì)于經(jīng)口灌胃的殼聚糖,其相對(duì)分子質(zhì)量(0.99、39.1、760kDa)越大,則相同時(shí)間的血藥濃度越低。麥冬多糖ROP經(jīng)20～40kDa的聚乙二醇修飾后尾靜脈注射,在大鼠血液中的消除半衰期(0.7h)增加了47～126倍,但經(jīng)2和5kDa聚乙二醇修飾后的消除半衰期無(wú)顯著增加。不同結(jié)構(gòu)多糖表現(xiàn)出的PK-相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系存在明顯的差異:相對(duì)分子質(zhì)量并不影響肝細(xì)胞對(duì)阿拉伯半乳聚糖的結(jié)合攝取;肝細(xì)胞對(duì)陽(yáng)離子葡聚糖絲裂霉素C結(jié)合物的攝取能力隨相對(duì)分子質(zhì)量的增加而增強(qiáng);大鼠和小鼠肝細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記葡聚糖的攝取清除隨相對(duì)分子質(zhì)量的增加而減少。向大鼠靜脈注射不同相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)的硫化多糖,發(fā)現(xiàn)腎臟對(duì)這些大分子的選擇滲透性與其分子尺寸相關(guān),但不同結(jié)構(gòu)多糖實(shí)現(xiàn)腎臟排除的極限相對(duì)分子質(zhì)量有所不同,對(duì)于硫化葡聚糖大約為8kDa,而硫化軟骨素為30kDa。

3.1.2電荷性質(zhì)肝細(xì)胞表面帶負(fù)電荷,對(duì)陽(yáng)離子多糖的攝取率較陰離子多糖高。帶正電荷的氨基多糖納米微粒經(jīng)荷瘤小鼠口服吸收后在肝臟中的分布量最高,其次是腎臟以及瘤組織。同樣,腫瘤細(xì)胞表面的負(fù)電荷性較正常細(xì)胞強(qiáng),更易吸附攝取正電荷多糖。氨基多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞較高的親和能力在一定程度上取決于影響電勢(shì)的脫乙酰度。但Takakura等的論點(diǎn)截然相反,認(rèn)為陽(yáng)性多糖靜脈注射后在腫瘤小鼠體內(nèi)經(jīng)肝臟和腎小球快速消除,而陰性多糖在體內(nèi)保留時(shí)間較長(zhǎng),表現(xiàn)出較高的腫瘤放射性蓄積。對(duì)于抗腫瘤活性多糖,其腫瘤組織分布量和腫瘤細(xì)胞攝取能力之間可能存在一定矛盾。

3.1.3脂質(zhì)化和納米化脂質(zhì)化能有效改變香菇多糖在比格犬和大鼠體內(nèi)的PK特征,顯著增加血清中多糖的t1/2α、t1/2β和MRT。經(jīng)尾靜脈注射給藥后,香菇多糖在小鼠體內(nèi)的靶向效率順序?yàn)槠?gt;肝>心>腎>肺,而香菇多糖脂質(zhì)體為脾>肝>肺>心>腎。經(jīng)腹腔注射給藥后,香菇多糖在大鼠體內(nèi)的靶向效率順序?yàn)槠?gt;肝>腎>肺>心,而香菇多糖脂質(zhì)體為脾>肝>肺>腎>心。氨基多糖主要黏附于Caco-2細(xì)胞表面,通過細(xì)胞間隙途徑進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)運(yùn),而納米化后能夠跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,且該途徑為協(xié)助擴(kuò)散,不受溫度影響,由此說(shuō)明納米化有利于提高氨基多糖跨腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。

3.2給藥方式

3.2.1灌胃和注射給藥的比較Caco-2細(xì)胞模型的Papp值顯示肉蓯蓉多糖屬吸收不良藥物,多糖經(jīng)灌胃給藥后對(duì)小鼠吞噬功能和免疫器官指數(shù)無(wú)顯著影響,而腹腔注射給藥的效果明顯。同樣,銀耳多糖灌胃給藥后,僅有微量進(jìn)入大鼠血液,絕大部分通過胃腸排出體外。而經(jīng)靜脈注射后,銀耳多糖在血液中清除速度很低,主要分布于肝臟、腎臟和腸道中,并最終由腎臟排除。六味地黃多糖CA4-3經(jīng)靜脈注射和灌胃后的血藥濃度變化明顯不同,灌胃給藥的吸收率僅為靜脈注射的35.9%。相對(duì)分子質(zhì)量5kDa的麥冬多糖FOJ-5經(jīng)靜脈注射后,在大鼠血漿中的消除半衰期(15mg•kg1,18.1min)要比灌胃給藥的半衰期短(50mg•kg1,28.9min)。

3.2.2不同注射方式的比較茯苓多糖硫酸酯(PS)經(jīng)腹腔注射后在大鼠體內(nèi)的消除半衰期、血漿清除率、表觀分布容積和AUC等均高于尾靜脈注射,兩種方式的PS消除均符合一房室、一級(jí)消除的開放模型。而麥冬多糖聚乙二醇修飾物經(jīng)靜脈注射和皮下注射給藥后,在大鼠體內(nèi)的消除行為基本相同,給藥劑量與AUC呈良好的線性關(guān)系,但后者在體內(nèi)平均滯留時(shí)間較前者增加了2.4倍。此外,來(lái)航雞經(jīng)腹腔注射藥用真菌8301多糖的吸收速率要顯著高于胸肌注射。

3.3給藥劑量靜脈注射和皮下注射的麥冬多糖聚乙二醇修飾物在大鼠體內(nèi)的AUC0∞和CL隨劑量(9～50mg•mL1)的增加而增大,但消除半衰期t1/2、表觀分布容積Vd和MRT0∞與劑量無(wú)線性相關(guān)。隨著灌胃劑量的增加,貽貝多糖MA在大鼠體內(nèi)的消除半衰期t1/2和MRT減小,Cmax、tmax、AUC0∞和CL增大,劑量與Vd值無(wú)明顯線性關(guān)系。香菇多糖脂質(zhì)體在比格犬血清中的t1/2α、t1/2β、MRT、AUC和Cmax隨靜脈注射劑量的增加而增加,劑量與Vd、CL和tmax值無(wú)明顯線性關(guān)系。由此可見,不同多糖的PK量效關(guān)系存在差異。小鼠肝臟對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量40kDa的葡聚糖的攝取表現(xiàn)出一定的劑量依賴性,劑量越大,肝臟攝取量越小。葡聚糖在糖尿病小鼠肝臟中蓄積的顯著降低與其高血糖作用有關(guān),高滲介質(zhì)能抑制大分子的細(xì)胞內(nèi)吞作用。此外,肝臟對(duì)阿拉伯半乳聚糖的攝取也具有明顯的劑量依賴性,但劑量并不影響腎臟對(duì)其攝取。

4小結(jié)與展望

多糖既是特異的功能因子,又是重要的功能載體,受到生物醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域?qū)W者的高度關(guān)注,并展示出廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前,多糖的提取純化及功效評(píng)價(jià)已相對(duì)成熟,且在結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)效關(guān)系及作用通路等分子機(jī)制等方面也取得了大量研究成果。然而其PK研究卻顯得十分薄弱,相比其他功能小分子,主要的挑戰(zhàn)在于:①多糖結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致其定量檢測(cè)難度大,且靈敏度往往難以滿足生物樣品分析;②多糖在體內(nèi)的代謝清除過程十分復(fù)雜,即使有足夠靈敏的檢測(cè)方法,也無(wú)法確定結(jié)果的真實(shí)性,還需進(jìn)行定性分析;③多糖不可能如小分子物質(zhì)那樣純化可得到單一成分,均一多糖也只是相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)集中的一類多糖混合物,可能存在不同的電荷性質(zhì)、糖苷鍵鏈接和分子構(gòu)象等,并表現(xiàn)出不同的PK特征;④多糖的PK不僅與自身的理化性質(zhì)、給藥方式及劑量密切相關(guān),還可能受其他物質(zhì)如腸道吸收促進(jìn)劑的影響。多糖的PK是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)研究,而后期的研究重點(diǎn)可能將主要集中在兩個(gè)方面。首先,研究建立生物樣品中原形多糖的定量和定性檢測(cè)方法,該方法應(yīng)具有較高的靈敏度和較低的檢出限。其次,結(jié)合多糖的改性技術(shù),深入探究其理化特征與PK和生物功效之間的關(guān)聯(lián)性,為指導(dǎo)多糖的分子修飾及應(yīng)用方案制定奠定理論基礎(chǔ)。

作者：易陽(yáng)王宏勛何靜仁單位：武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院