Nrf2下的腫瘤化學防控分析范文
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本文作者：劉文博譚曉斌賈曉斌佘嗣明單位：江蘇省中醫藥研究院中藥新型給藥系統重點實驗室安徽大學生命科學院
隨著環境污染的日益嚴重和人們生活習慣的改變，惡性腫瘤的發病率也在逐年上升。預計到2020年，中國新發腫瘤病例將達到349萬，因惡性腫瘤而死亡的人數約263萬[1]。可以看出，在今后相當長的一段時間中，我國腫瘤防治任務十分艱巨。防微杜漸，預防腫瘤的發生，對降低腫瘤發生率及死亡率具有舉足輕重的作用。中醫“治未病”的預防疾病思想，其核心思想是未病先防。現代醫學也提出化學預防的概念，通過某些藥物從而抑制腫瘤于未起時，可以十分有效地降低腫瘤發生及死亡率。
1化學預防是中醫“治未病”的策略之一
化學預防（chemoprevention）這個名詞在1976年由MichaelSporn創造，定義為利用天然、合成的物質來阻止、抑制或者逆轉癌癥啟動、促進和進展過程，從而降低癌癥發生率和死亡率的策略。中醫經過長期的實踐，逐步形成了“治未病”的理論體系，是中醫預防疾病思想的高度概括，預防方法獨特，有著重要的意義。“治未病”思想貫穿于中醫防治腫瘤的全過程，與現代醫學的化學預防有異曲同工之妙。
1.1中醫“治未病”的核心思想是未病先防
中醫一貫強調“治未病”的預防策略，《黃帝內經》提出“治未病”的預防醫學觀點：“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂，此之謂也。夫病已成而后藥之，亂已成而后治之，譬猶渴而穿井，斗而鑄錐，不亦晚乎！”所謂“治未病”就是說注重的是未病先防，未雨綢繆，把預防、保健、養生、防病放在首位，包括未病先防、已病防變、愈后防復，其中主要體現了未病先防的思想。未病先防是指采用適當的養生方法，包括飲食、藥物、情緒調節等來預防疾病（包括腫瘤）的發生。《內經》提出了未病先防的一般原則，即“法于陰陽，和于術數，食飲有節，起居有常，不妄作勞，故能形與神俱，而盡終其天年，度百歲乃去”。現代科學認為，腫瘤的發生有遺傳、慢性疾病等因素，但主要是由于外界的致癌因素導致基因發生變化、抑癌基因失活、原癌基因激活。中醫認為腫瘤的發生可能與正氣內虛、臟腑失調、邪毒郁熱、氣滯血瘀有關。所謂正氣是指體內的元氣，是人體正常功能及保持健康的能力，包括自我調節、適應環境、免疫力等，而邪氣是指多種致病因素，包括環境中的寒、暑、煙氣，飲食中的變質食物，食積，還有精神因素等。從某種意義上說，人體的免疫系統、抑癌基因以及凋亡、自噬機制是正氣，而外界的致癌因素可以理解為邪氣。“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”說明正氣不足是腫瘤發生的內在依據，故滋陰補生、扶正固本類方劑對于提高機體的免疫功能及防御腫瘤有一定的療效。現代醫學和生命科學在一定程度上證明了中醫藥的科學性，如人參是傳統補益中藥，具有補氣生血、扶正祛邪等功效，可以大補元氣、固脫生津、安神，治氣血津液不足之證。而現代分子生物學研究表明人參中的主要有效成分人參皂苷可以增加小鼠脾臟、胸腺質量，白細胞介素2（IL-2）水平，從而促進T細胞增殖，活化B細胞和巨噬細胞，增強免疫力，另外人參皂苷具有降低膽固醇的作用，可以減少患心血管疾病的風險[2-5]。
1.2中藥“食療”的化學預防作用
化學預防是在惡性腫瘤發生之前利用飲食和特定的天然或人造物質去阻止、抑制或逆轉致癌過程。從某種程度上說化學預防是“治未病”的一方面，相當于中醫藥中的“食療”，它所強調的是人體攝入有預防腫瘤作用的物質。中醫很早就認識到食物不僅能營養身體，而且還能祛病，重視食物在“養”和“治”方面的特性。具有化學預防作用的藥物大多是從天然食物中提取的活性成分及其衍生物。目前，利用中藥進行腫瘤的化學預防已成為研究熱點。紅參，本草綱目記載其有“補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，明目益智，久服輕身延年”的功效。Yan等[6]用10mg/mL的紅參水飼養小鼠，在第2周用苯并芘誘導肺癌發生，第20周處死，取出肺臟，發現腫瘤的抑制率達到35.59%，腫瘤負荷（腫瘤數×腫瘤體積）抑制率為70.10%。在飼料中添加1%紅參提取物飼養易自發肝癌的C3H/He小鼠40周，發現對照組小鼠平均每只1.06個瘤，而給藥組為0.33個，表明紅參有預防肝癌和肺癌的作用[7]。綠茶，《本草綱目》記載其味苦、甘，微寒無毒，主治瘺瘡，有利小便、祛痰熱、止渴、下氣消食的功效。在小鼠的飼料中添加1%去咖啡因的綠茶兒茶素混合物制劑，可以顯著抑制苯并芘誘導的肺癌的發生及惡化[8]。
2nrf2/ARE信號通路在化學預防中的重要作用
Nrf2/ARE通路是化學預防的重要信號通路，其對細胞抵御外源性致癌物質和氧化物質，以及內源性的氧化應激發揮重要作用。Nrf2/ARE通路的缺失和失活與腫瘤的發生、肝炎、心腦血管疾病等有著密切聯系。在正常細胞中，Nrf2（NF-E2相關因子2）蛋白與其伴侶蛋白（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）結合，處于抑制狀態，當受到活性氧、親電子物質或者上游信號通路——促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的刺激后，Keap1與Nrf2解離，Nrf2被激活，繼而與肌腱纖維瘤蛋白（muscleaponeuroticfibrosarcomaprotein，Mafp）以異二聚體的形式結合，該異二聚體再與ARE（抗氧化反應元件）結合，從而啟動下游基因的轉錄。Nrf2/ARE通路的下游基因主要有：II相解毒酶、氧化還原酶類、轉運蛋白[9]（圖1），其中II相解毒酶和氧化還原酶是目前的研究熱點。
中藥可以調節人體機能，提高免疫力，預防腫瘤的發生，也可以改善腫瘤患者的臨床癥狀，延長生存期，與化學藥結合使用可起到減毒增效的作用，又有低毒、廉價等優勢。但由于中藥成分復雜，藥效物質基礎及作用規律不明確，起效慢，加之西醫治療腫瘤采用的是瘤體變化的客觀評價指標，而中西醫結合腫瘤治療注重患者的生存時間和生活質量，中西醫療效評價目標不明確，導致中藥難以在國際上推廣。采用國際上通用的方法對中藥的化學預防作用進行研究，將中藥研究與生物化學、細胞生物學、分子生物學相結合，通過研究中藥成分對細胞蛋白、DNA、RNA表達的影響從而判斷其對體內信號通路的影響。
3基于Nrf2通路的中藥化學預防作用
3.1PKC、PI3K、MAPK信號通路對Nrf2/ARE的調控及中藥的干預作用
目前認為PKC、PI3K、MAPK3條信號通路是調控Nrf2/ARE信號轉導通路激活的主要途徑[10]。PKC可以直接磷酸化Nrf2與Keap1結合區域中的絲氨酸40位點，從而導致Nrf2與Keap1的解離，激活Nrf2；PI3K可能是由肌動蛋白解聚和微絲肌動蛋白重排，使Nrf2在核內積聚，從而激活下游信號途徑；MAPK包括細胞外調節激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK），p38MAPK、ERK和JNK可以通過磷酸化轉錄共激活因子直接激活Nrf2，而p38在不同的細胞中對Nrf2有著不同的作用[11]。萊菔硫烷（SFN）是一種異硫氰酸鹽，具有化學預防作用，是國內外的研究熱點，廣泛存在于毛獨行等十字花科植物中。SFN一方面可以激活Nrf2上游MAPKs，繼而激活Nrf2蛋白，促使其與Maf蛋白結合形成二聚體；另一方面，SFN可以通過改變Keap1蛋白的構象而使Nrf2蛋白與Keap1蛋白解離，從而達到激活Nrf2蛋白，繼而激活下游相關基因表達的目的[12]。Shan等[13]發現在人膀胱癌細胞株T24中，SFN可以顯著性增加GSTs基因家族之一的GSTA1-1和TrxR的表達，并可以下調環氧化酶2（COX-2）的表達，而將一種MAPK特異性抑制劑SB202190與SFN聯合給藥可將上述的現象消除；另一方面，加入MAPK的激動劑茴香霉素可以提高SFN上調GST和TrxR的表達及下調COX-2的表達。
表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從綠茶中提取的一種活性成分，是兒茶素中量最高的組分，占綠茶鮮質量的9%～13%[14-15]。Chen等[16]發現在人肺癌細胞株A549中，EGCG可以誘導Nrf2介導的HO-1表達，在人肝癌細胞株HepG2培養時加入25μmol/LEGCG可以激活MAPK家族的所有成員，包括ERK、JNK、p38，濃度達到1mmol/L時可以通過增加caspase3表達而誘導細胞凋亡。EGCG在人乳腺癌細胞株MCF10A中可以激活ERK1/2，進而促使Nrf2在細胞核內積累，從而誘導SOD和HO-1的表達，但當Nrf2基因沉默后，HO-1和SOD的表達均減少[17]。
3.2通過Nrf2途徑誘導的II相解毒酶
由于環境日益惡化，人們接觸到多環芳香烴類、黃曲霉素、煙氣、亞硝胺類物質的機會越來越多，這些致癌物進入人體后首先經過I相代謝酶（如細胞色素P450）的作用，形成親電子的活性中間體，進而攻擊細胞中的大分子，如DNA和蛋白質，導致癌癥的發生[18]。黃曲霉素B1（AFB1）就是在細胞色素P450的氧化作用下形成8,9-環氧化AFB1，后者可以與DNA結合，進而誘發癌變[19]。使這些親電子的活性中間體解毒或去除的反應稱為II相代謝，其主要作用機制是通過將這些親電子化學物質硫酸化、糖脂化、谷胱甘肽化或中和，從而達到降低其毒性，或者增加其溶解度，使其容易從體內排出。而這些反應都是由II相解毒酶介導的。II相代謝解毒酶主要有谷胱甘肽轉硫酶（GST）、NADP（H）醌氧化還原酶（NQO1）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）[19]。GST廣泛存在于生物體內，是一種重要的II相解毒酶，其主要作用是催化還原型谷胱甘肽（GSH）與親電子物質結合，繼而排出體外，與膽紅素、甾醇等親脂性物質相結合，抑制脂質過氧化反應。NQO1也是一種廣泛存在于真核生物細胞中的II相解毒酶，其將體內的醌類等異源性物質還原為氫醌，繼而被結合排泄，避免醌類物質轉化為半醌類，從而達到保護細胞的作用。UGT是最主要的II相解毒酶，在機體各組織中都有發現，在肝臟中活力最高，其主要作用是催化葡糖醛酸與外源性底物（如多環芳香烴類、胺類）和內源性底物（如膽紅素、固醇類）結合，從而易于排出體外。
從姜黃、莪術等中藥中提取的姜黃素（curcumin），由于其具有抗氧化和抗腫瘤作用[20]，是近年來的研究熱點。Jones等[21]每天喂養雄性F344大鼠45mg/kg姜黃素，第6天取出大鼠的肝、腎、前列腺和膀胱，發現組織內的總GST和GST-μ亞型的活性顯著提高，NQO1的活性也有所增加，證明姜黃素可以提高II相解毒酶的活性，具有化學預防作用。Garg等[22]在小鼠飼料中添加0.01%和0.05%的姜黃素，連續喂養16d，在第15天時ig1mg的苯并芘，第16天處死，取出肝和肺，結果發現給藥組小鼠的肝、肺組織GST、NQO1的活性，蛋白和mRNA的表達與對照組有著顯著性差異，同時也表現出劑量相關性。
Liu等[23]用銀杏黃酮作用小鼠肝癌細胞株Hepa1c1c7與人肝癌細胞株HepG2，發現GST酶活力上升；利用免疫印記發現GST家族中一個重要成員GST-P1的蛋白表達量顯著增加，且呈劑量相關性，用實時PCR檢測Hepa1c1c7中GST-P1的mRNA表達情況也得出了相同的結果，表明銀杏有著化學預防作用。用添加0.5%的銀杏黃酮飼料喂養大鼠1周后，發現給藥組大鼠的肝臟質量、GST活力有所增加，在停止給藥3周后GST的活力下降到正常水平[24]。
甘草有清熱解毒、祛痰止咳的功效，在人肝癌細胞株HepG2中可以誘導UGT的表達，也可以在小鼠體內提高II相解毒酶的表達，但在Nrf2基因敲除的小鼠中則無上述作用，證明甘草是通過Nrf2途徑激活II相解毒酶的[25]。
3.3通過Nrf2途徑誘導氧化還原酶
活性氧能夠氧化細胞膜上的脂類，損傷細胞膜及細胞中的蛋白質、糖類和DNA；活性氧的增加以及氧化還原平衡的打破可以導致腫瘤發生。人體中存在一些氧化還原酶類，它們在化學預防腫瘤中起著重要的作用，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）、硫氧還蛋白（Trx）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）、過氧化物氧還蛋白（Prx）和血紅素加氧酶1（HO-1）等。
SOD能專一地清除體內的超氧離子自由基，將其催化成為過氧化氫；而CAT則可以將體內眾多反應產生的過氧化氫分解為水和氧氣，還可以催化分解甲酸鹽、亞硝酸類物質；GSH-Px利用GSH與過氧化氫反應，催化生成氧化性谷胱甘肽（GSSG）和水，而GCL是GSH合成的重要限速酶；還原態的硫氧還蛋白[Trx-(SH)2]通過巰基的供氫使其他蛋白還原，自身轉化為氧化態的硫氧還蛋白（Trx-S2），而TrxR是將氧化態的硫氧還蛋白轉化成還原態；Prx也可以清除體內過氧化氫，但其效率遠低于CAT、GSH-Px；有報道稱Prx與腫瘤有著密切聯系，參與細胞的增殖、分化和凋亡；HO-1將血紅素分解為CO、膽綠素和鐵，這些代謝產物均與體內抗氧化反應密切相關，從而起到保護細胞的作用。
從蓼科植物虎杖的根莖中提取出的白藜蘆醇（resveratrol）具有很強的抗氧化活性[26-27]，Kode等[28]用不同濃度的白藜蘆醇處理人肺腺癌A549細胞，發現加入白藜蘆醇的細胞GSH、GCL、GSH-Px的活性和蛋白水平都有顯著性提高，活性氧（ROS）的量相對于對照組顯著降低；利用熒光素酶發現細胞核內Nrf2水平大量增加，利用siRNA敲除Nrf2基因后再加入白藜蘆醇，發現這些氧化還原酶的量并沒有提高，提示白藜蘆醇是通過Nrf2途徑增加抗氧化酶的表達。用含有白藜蘆醇的培養基培養人支氣管上皮細胞NBE1，發現細胞中的GSH量升高，GCL的催化亞基（GCLC）和調節亞基（GCLM）的mRNA轉錄增加，而Nrf2基因沉默后則上述現象均消失[29]。
番茄紅素（lycopene）是植物中的一種天然色素，也是一種強抗氧化劑。近年來，番茄紅素的抗氧化活性引起了人們的密切關注，成為研究的熱點。在人支氣管上皮細胞BEAS-2B中，番茄紅素可以通過激活Nrf2入核，從而激活下游氧化還原酶HO-1、GCL的表達；番茄紅素還可以通過提高GSH的量，減少ROS的生成，從而減少H2O2對細胞的傷害[30]。
3.4通過Nrf2途徑調控轉運蛋白的表達
體內的轉運蛋白主要是多藥抗藥性相關蛋白（MRP），其作用是運輸陰離子藥物和谷胱甘肽、葡萄糖醛酸和硫酸共軛物，將膽汁和血液中的有毒代謝產物迅速去除，從而達到解毒的目的。它對藥物在體內的代謝吸收起著重要作用，也與藥物的不良反應密切相關，具有保護細胞的作用。
熊去氧膽酸是從熊膽中提取或者由豬膽中的豬去氧膽酸合成的中藥活性成分，有著激活Nrf2通路介導的轉運蛋白的作用。Keap1基因抑制的小鼠中Nrf2表達量顯著升高，同時Mrp2、Mrp3和Mrp4的表達量也有明顯提高，其中Mrp3和Mrp4的升高顯著，正常小鼠總膽酸的濃縮物也有增加；用100、300μmol/L的熊去氧膽酸作用大鼠肝上皮細胞可以使Nrf2和MRP的表達量升高[31]。
4結語與展望
預防腫瘤意義重大，中醫藥“治未病”思想對其具有重要的指導意義。中藥及活性成分能通過Nrf2/ARE信號通路誘導II相解毒酶、抗氧化酶類及MRP的表達，發揮其化學預防腫瘤的作用。建立中藥基于Nrf2信號通路化學預防腫瘤研究技術體系，研究中藥防治癌癥的作用及機制，對于詮釋“治未病”的本質內涵意義重大，為發現新的腫瘤化學預防中藥及復方藥物提供思路及方法。