中藥夏枯草對甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘率范文

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作者：張王峰,付強(qiáng),趙華棟,徐海峰，周潤鎖,袁夢暉,周飛華,南菁

【摘要】目的：探討中藥夏枯草對甲狀腺癌細(xì)胞株K1鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(nis)基因表達(dá)及攝碘率的影響，為夏枯草輔助放射性碘治療甲狀腺癌提供依據(jù).方法：分別以不同濃度(0,20,50,100,150,200g/L)的夏枯草處理體外培養(yǎng)的甲狀腺癌細(xì)胞株(K1)，48h后利用半定量RTPCR檢測細(xì)胞NISmRNA表達(dá)，γ計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞攝碘能力.結(jié)果：夏枯草濃度在0～100g/L范圍內(nèi)，細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘能力隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05).當(dāng)夏枯草濃度達(dá)150～200g/L時，增加后濃度與100g/L濃度相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)論：夏枯草可上調(diào)甲狀腺癌K1細(xì)胞NIS基因表達(dá)，增強(qiáng)其攝碘率，而且這種作用在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性.

【關(guān)鍵詞】夏枯草；甲狀腺腫瘤；腫瘤細(xì)胞；RTPCR；碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體；攝碘率

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectoftraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisontheexpressionofsodiumiodidesymporter(NIS)geneandradioiodideuptakeinthyroidcancercellline(K1),soastoevaluatethesignificanceoftraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisinthetreatmentofthyroidcancerwithradioiodide.METHODS：Thethyroidcancercellline(K1)wastreatedwithtraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisatconcentrationsof0,20,50,100,150,200g/Lfor48h.TheexpressionlevelofNISmRNAofK1wasdeterminedbyRTPCRanditsradioiodideconcentrationactivitywasmeasuredbyγcounter.RESULTS：TraditionalChinesemedicinePrunellavulgarisattheconcentrationbetween0and100g/LincreasedtheexpressionofNISgeneandtheradioiodideuptakeofK1.Therewasnosignificantdifferencebetween150-200g/Land100g/L(P<0.05).CONCLUSION：TraditionalChinesemedicinePrunellavulgariscouldincreasetheexpressionofNISgeneandtheactivityofradioiodideconcentrationofthyroidcancercellline(K1)inadosedependentmanner．TraditionalChinesemedicinePrunellavulgarismayplayaroleinthetherapyofthyroidcancer.

【Keywords】Prunellavulgaris；thyroidneoplasmstumorcells；RTPCR；NIS；radioiodideuptake

0引言

中藥夏枯草治療甲狀腺腫瘤有悠久歷史，目前多種專利報(bào)道的抗癌中成藥的主要成分也是夏枯草［1-3］.臨床治療中，甲狀腺癌對化療藥物不敏感，而放射性碘治療分化型甲狀腺癌療效確切.如何提高甲狀腺癌細(xì)胞的攝碘率是目前研究的熱點(diǎn).鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Sodium/IodideSymporter，NIS)基因被認(rèn)為與甲狀腺細(xì)胞對碘的攝取有密切關(guān)系.本研究以人甲狀腺癌細(xì)胞系K1為研究對象，觀察了夏枯草對甲狀腺腫瘤細(xì)胞鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體NIS基因表達(dá)及攝碘率的影響，從而探討夏枯草能否增加甲狀腺癌對碘的攝取以起到增加放射性碘對甲狀腺癌的療效.

1材料和方法

1．1材料NU2500型CO2培養(yǎng)箱（美國HUAIRE公司）；GU20低溫高速冷凍離心機(jī)（江蘇太倉醫(yī)療儀器廠）；SWCJIF凈化工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1（歐洲細(xì)胞培養(yǎng)中心），于飽和濕度、37℃，50mL/LCO2的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)；Na125I（成都中核高通同位素有限公司生產(chǎn)，放射化學(xué)純度99.7%無載體pH8.0）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；Trizol（Gibco公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；PCR酶為rTaKaRa(寶泰克公司)；PCR反應(yīng)引物（北京奧科生物技術(shù)公司）.NIS上游引物序列為5′tggttaagggaccggaagacatc3′，下游引物序列為5′agttgcctactgcaatctacaagg3′，產(chǎn)物片段為342bp.GAPDH（3磷酸甘油醛脫氫酶），上游引物序列為5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′，下游引物序列為5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′，產(chǎn)物片段為310bp.夏枯草配制：40g夏枯草加水400mL，煮沸30min并過濾除渣，熬制濃縮液定容至40mL，濾液濃縮濃度為1g/mL，經(jīng)120℃30min高壓滅菌后，用直徑為22μm的微孔濾膜正壓過濾，使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需的不同濃度梯度.

1.2&nb

sp;方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×108個/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，24h后懸浮細(xì)胞貼壁，然后換以新的培養(yǎng)液加入不同濃度夏枯草（0，20，50，100，150，200g/L）.作用48h后收集細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測.

1．2.2RTPCR檢測NISmRNA的表達(dá)取1×108個/L細(xì)胞，加1mLTrizol裂解液于培養(yǎng)瓶中，用細(xì)胞刮勺將細(xì)胞充分刮下，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，室溫5min，加200mL氯仿，混勻，室溫5min，4℃離心，8000r/min，15min，將上清轉(zhuǎn)入新管，加5mL異丙醇，混勻，室溫10min，4℃離心，8000r/min，10min.去上清，加1mL750mL/L乙醇(DEPC水配制)，4℃離心，8000r/min，5min.去上清，沉淀物加去離子水溶解，讀取A260nm測量RNA濃度.每個樣品取1μgRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，于20μL反應(yīng)體系中加入oligodT(500mg/L)1μL，細(xì)胞總RNA1μg，dNTP（2．5mmol/L）4μL，加水至12μL，65℃，5min.冰浴2min，短時離心后加入5×反應(yīng)緩沖液4μL，0.1mol/LDTT2μL，RNaseOUT重組核糖核酸酶抑制劑(40U/μL)1μL，混勻，42℃，2min，加反轉(zhuǎn)錄酶1μL(200U/μL)，42℃，50min，70℃，15min后終止反應(yīng).PCR擴(kuò)增在25μL體系中加入10×反應(yīng)緩沖液2.5μL，dNTP(2.5mmol/L）4μL，模板(cDNA)2μL，上游引物與下游引物各2μL(10μmol/L)，PCRTaq酶1U，加水至25μL.PCR條件：以GAPDH基因表達(dá)產(chǎn)物為內(nèi)參照進(jìn)行半定量RTPCR，NIS循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，繼以94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃延伸10min.GADPH循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，繼以94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃延伸10min.各取10μLPCR反應(yīng)液在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相.KodakDigitalScienceID軟件系統(tǒng)掃描，測定光密度值并計(jì)算NIS／GAPDH光密度比值.其結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1．2．3γ計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞攝碘能力夏枯草作用48h后收集細(xì)胞于小試管，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每管的細(xì)胞個數(shù)為1×106個.離心棄上清，用PBS清洗兩次.向每個試管加入lmL含125I的HBSS溶液(含37kBq125I)［10］，將試管于37℃放置1h，離心去除上清液，用HBSS洗兩次.于γ計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞的攝碘水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件.數(shù)據(jù)以x±s表示.計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)和方差分析處理.P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2．1RTPCR檢測NISmRNA經(jīng)不同濃度的夏枯草處理48h后，K1細(xì)胞NISmRNA水平上調(diào)(圖1).當(dāng)夏枯草濃度在0～150g/L范圍內(nèi)，基因表達(dá)隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05).當(dāng)夏枯草濃度達(dá)200g/L時，NISmRNA的增加與前一濃度相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

A：NIS的表達(dá)；B：GAPDH的表達(dá).M：marker.

圖1RTPCR分析NIS基因在不同濃度夏枯草作用下的表達(dá)（略）

2．2γ計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞攝碘能力20g/L的夏枯草作用后細(xì)胞攝碘能力便出現(xiàn)增強(qiáng)，隨著夏枯草濃度的增加細(xì)胞攝碘能力逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，但150g/L濃度組與100g/L濃度組相比增加不明顯(P>0.05，圖2).

圖2夏枯草對甲狀腺癌細(xì)胞攝碘能力的影響（略）

3討論

研究報(bào)道單味藥夏枯草經(jīng)水煎醇提法制成的夏枯草注射液對胃癌、大腸癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明夏枯草具有一定的抗腫瘤作用，可以改善病情，提高生存質(zhì)量［4-5］.

鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)是存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底側(cè)細(xì)胞膜上的一種糖化膜蛋白，即所謂的“碘泵”，其功能主要是將血液中的碘攝取入甲狀腺濾泡細(xì)胞內(nèi)，以便合成甲狀腺激素.1996年，Dai等［6］首先從FPTL5細(xì)胞的cDNA文庫中克隆出鼠NIS基因，同年，Smanik等［7］用針對鼠NIScDNA序列的引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增出人類NIS(hNIS)的細(xì)胞cDN段，隨后從人甲狀腺細(xì)胞cDNA文庫中克隆出hNIS.hNIS基因位于19號染色體上，整個編碼區(qū)由15個外顯子及14個內(nèi)含子構(gòu)成，其開放閱讀框架為1929個核甘酸，編碼643個氨基酸殘基［7］.研究發(fā)現(xiàn)［8］，在不同病理狀態(tài)下，甲狀腺組織NIS基因表達(dá)存在明顯差異.自主功能性腺瘤、Graves病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者NIS的表達(dá)增加.而在甲狀腺癌組織中，NIS的表達(dá)一般均低于正常甲狀腺組織.Franco等［9］利用RTPCR方法比較了正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織中NIS基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，在甲狀腺癌組織中，NIS基因的表達(dá)普遍低于正常甲狀腺組織.甲狀腺癌組織NIS基因的降低導(dǎo)致其攝碘能力的下降.

文獻(xiàn)報(bào)道中藥能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，中藥及其配伍對多種腫瘤細(xì)胞均具有一定的誘導(dǎo)分化作用［10］.本課題結(jié)果顯示經(jīng)一定濃度的夏枯草刺激后，甲狀腺癌細(xì)胞系K1NIS基因表達(dá)水平及攝碘能力較對照組明顯提高.因此，我們認(rèn)為K1細(xì)胞NIS基因表達(dá)、攝碘能力的提高是夏枯草誘導(dǎo)細(xì)胞分化的結(jié)果.

甲狀腺癌分化程度越高，攝碘能力越強(qiáng).由于乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞具有一定的攝碘能力，因此利用放射性碘可進(jìn)一步去除術(shù)后的殘余灶及轉(zhuǎn)移灶，從而大大改善甲狀腺癌患者的預(yù)后.但甲狀腺癌攝碘能力低于正常甲狀腺組織限制了放射性碘治療的臨床應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺癌細(xì)胞株K1經(jīng)夏枯草處理后，NIS基因表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞的攝碘能力增強(qiáng)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為放射性碘治療甲狀腺癌

提供了新的思路.若能夠通過應(yīng)用夏枯草的誘導(dǎo)分化作用，誘導(dǎo)NIS基因的表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞向成熟階段分化，恢復(fù)或提高其攝碘能力，然后再結(jié)合放射性碘的聯(lián)合治療模式，則可能獲得滿意的臨床效果.但本實(shí)驗(yàn)是建立在體外細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上得出的結(jié)論，缺少體內(nèi)研究結(jié)果的證實(shí).其次，夏枯草誘導(dǎo)分化的機(jī)制尚不清楚，仍然處于實(shí)驗(yàn)研究階段，缺乏進(jìn)一步的臨床研究.今后應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)夏枯草誘導(dǎo)分化的體內(nèi)的研究與臨床觀察，發(fā)掘中藥夏枯草在腫瘤的治療中作用.

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