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【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤・阿霉素・腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)液・細(xì)胞周期・細(xì)胞大小・CA125・CA19
【摘要】目的：觀察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株frh0201生物學(xué)活性的影響。方法：用2μg/ml的阿霉素同一濃度逐漸延長(zhǎng)時(shí)間作用于人膽管癌細(xì)胞株FRH0201細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)作用篩選出能在含1μg/ml的阿霉素培養(yǎng)液中生存72h，去掉阿霉素后仍能繼續(xù)穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞。無藥培養(yǎng)1月后進(jìn)行生物學(xué)行為的監(jiān)測(cè)。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，繪制生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素的熒光強(qiáng)度。結(jié)果：阿霉素作用后FRH0201細(xì)胞形態(tài)學(xué)有輕度改變，細(xì)胞倍增時(shí)間較親本細(xì)胞延長(zhǎng)3h，與親本細(xì)胞相比S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。CA125和CA199試驗(yàn)組和親本組分別為9.14和8.60U/ml，1.59和2.96U/ml，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度（熒光強(qiáng)度平均值），親本細(xì)胞為1764.8，試驗(yàn)組細(xì)胞為305.4。結(jié)論：阿霉素對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201的形態(tài)學(xué)及倍增時(shí)間無明顯影響，但使細(xì)胞進(jìn)入S期、G2期的增多，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯降低，生長(zhǎng)時(shí)間無明顯變化。
【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤・阿霉素・腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液・細(xì)胞周期・細(xì)胞大小・CA125・CA199
TheeffectsofadramycinonthehumanliverhilarcholangiocarcinonacelllineFRH0201
【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatetheeffectsofadramycinoncelllineofFRH0201.Methods:Humanhilarcholangiocarcinonacelllinewereculturedwithadramycin(2μg/ml)throughlastingdifferenttimes,finallythiscelllinecansurviveafter72hculturedinthecultureliquidwiththeadramycin(1μg/ml).Thenthemediumwasreplacedwithafreshonewithoutadramycin,andthecellswerecontinuouslyculturedfor1month.Theinvitrostudiesincludedtheobservationoftheappearancewithopticalmicroscope,MTTcellproliferationassay,analysisofthecellcyclebyFlowcytometry(FACS),assaysoftumormarkerusingenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA),thefluorescencedensityofadramycin.Results:ComparedtotheparentFRH0201cellline:Themorphologyshowedtypicalmorphologicalcharacteristics,thedoublingtimeprolongedabout3h,thecellcyclebyflowcytometryidentifiedinG1,G2andSphaseofcellcyclewere40.50%,19.74%and39.77%intrialgroup,and69.83%,7.29%and22.88%inparentgroup,respectively.Tumormarkerhasnodifferencebetweenthem,thefluorescencedensityofepirubicindescending5.2times.Conclusion:Theadramycincanaffectthecellcycleandcausethechangeofmetabolism.
【KEYWORDS】Biliarytractneoplasms・Adramycin・Tumorcells,cultured・Cellcycle・Cellsize・CA125・CA199
目前，肝門部膽管癌手術(shù)切除率已明顯提高，手術(shù)病死率明顯下降，但真正達(dá)到根治性切除的病例很少，局部復(fù)發(fā)率很高，現(xiàn)有的化療及放療未見明顯的效果。其原因可能與肝門部膽管癌的生物學(xué)特性有關(guān)［1］。為此，我們觀察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201生物學(xué)活性的影響。
1材料和方法
1.1材料阿霉素購(gòu)于深圳萬樂公司，MTT購(gòu)自愛博生物工程有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。膽管癌細(xì)胞株FRH0201由本課題組吳小鵬教授構(gòu)建［2］。
1.2方法采用濃度相同不斷增加作用時(shí)間的方法確定阿霉素培養(yǎng)液終濃度為1μg/ml。首先分別向FRH0201細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入不同濃度的阿霉素（Adramycin,ADR），培養(yǎng)3d后觀察細(xì)胞死亡情況。結(jié)合阿霉素的血漿濃度，選擇可將50%的細(xì)胞抑制的藥物濃度（IC50）作為耐藥細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度（2μg/ml），將腫瘤細(xì)胞置于該培養(yǎng)液中和不含藥物的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，傳代兩次，再將篩選出的細(xì)胞在相同藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10個(gè)時(shí)間段約8個(gè)月的培養(yǎng)，最終使細(xì)胞能夠在1μg/ml阿霉素培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個(gè)月在檢測(cè)細(xì)胞的生物特性。
>1.3觀察指標(biāo)
1.3.1形態(tài)學(xué)觀察將兩株細(xì)胞分別爬片后經(jīng)HE染色，光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
1.3.2細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本細(xì)胞即未用藥的細(xì)胞和阿霉素作用的細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種200μ1，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個(gè)復(fù)孔計(jì)數(shù)活細(xì)胞，計(jì)算平均值，連續(xù)觀察7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸，繪制半對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，于生長(zhǎng)曲線上對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)取3組數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法進(jìn)行直線回歸，在直線上任取兩點(diǎn)（Nt、No），根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間(Td）［3］。T代表No~Nt的時(shí)間Td=T×Ig2/Ig(Nt/No）
1.3.3細(xì)胞周期分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各1×106個(gè)/ml，制成單細(xì)胞懸液，按試劑盒說明進(jìn)行操作，于流式細(xì)胞儀（FCM）上行細(xì)胞周期分析。
1.3.4腫瘤標(biāo)記物CA125、CA199分別將同等數(shù)量的親本及試驗(yàn)組細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別收集培養(yǎng)液各10ml，1000r/min離心5min后取上清，用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行CA125及CA199的檢測(cè)。
1.3.5激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)將親本細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞制備單層細(xì)胞爬片。將載玻片置于培養(yǎng)皿中10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻布滿載玻片后加入2μg/ml阿霉素作用30min，PBS洗滌細(xì)胞2次，在磁共振共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示。然后計(jì)算平均值。
2結(jié)果
2.1形態(tài)學(xué)改變倒置顯微鏡下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FRH0201細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌緊密排列，細(xì)胞呈多邊形、梭形、圓形、不規(guī)則形、三角形等各種形態(tài)，生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞體積變大，折光性差，核漿比例變大，細(xì)胞核增大。有多核細(xì)胞，有異常核分裂相。
2.2細(xì)胞倍增時(shí)間實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間為23.6h，延長(zhǎng)了約3h。
2.3細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與親本細(xì)胞相比：S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。見圖1、2。
2.5激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算平均值。見圖3。
3討論
肝門膽管癌及膽囊癌術(shù)后化療是重要的輔助治療手段，但化療的敏感性不高。且可能存在個(gè)體性差異及可能誘發(fā)的腫瘤多藥耐藥性。為了臨床及基礎(chǔ)方面對(duì)膽道惡性腫瘤綜合治療的研究，F(xiàn)RH0201細(xì)胞代表原發(fā)灶的所有細(xì)胞群體［2］，并已成功建立裸鼠動(dòng)物模型［3、4］，我們用阿霉素對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀察對(duì)其生物學(xué)特性的影響。為了更接近臨床膽管癌化療反復(fù)間歇用藥的特點(diǎn)，對(duì)FRH0201細(xì)胞采用大劑量反復(fù)間歇同一濃度不同時(shí)間暴露，歷時(shí)8個(gè)月，獲得了穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞。本次試驗(yàn)不同于其它耐藥株固定藥物濃度，這更符合臨床用藥方式。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在低氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞在含有阿霉素的培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，一旦更換培養(yǎng)基后同樣劑量的藥物，細(xì)胞雖然可以繼續(xù)貼壁伸展。但藥物持續(xù)存在時(shí)卻出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸減少。該細(xì)胞生物學(xué)特性的研究將為下一步耐藥株的建立，探討膽管癌耐藥機(jī)理及逆轉(zhuǎn)耐藥奠定基礎(chǔ)。以往研究發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞株比較，耐藥細(xì)胞株在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝水平等方面均發(fā)生了顯著變化［5］。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在無藥培養(yǎng)1個(gè)月后生長(zhǎng)穩(wěn)定，倍增時(shí)間稍有延長(zhǎng)，其分泌的腫瘤標(biāo)記物如CA125、CA199較親本細(xì)胞有所降低，這可能與藥物抑制細(xì)胞活性有關(guān)，也可能是藥物導(dǎo)致了細(xì)胞的分化有關(guān)，但是細(xì)胞排泄毒性藥物的作用得到了增強(qiáng)。我們推測(cè)這些生物學(xué)性狀的改變與其耐藥表型密切相關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理前后試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比親本組約減少29.33%，G2期細(xì)胞比親本組增加12.46%，S期細(xì)胞增多16.89%，說明細(xì)胞通過細(xì)胞周期限制從G1期進(jìn)入S期，然后阻滯于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色質(zhì)的螺旋化，此期對(duì)外界環(huán)境敏感，易受各種因素的影響［6］。提示根據(jù)藥物對(duì)膽管癌細(xì)胞周期各期的影響，在臨床上可以更好地選擇不同的化療藥物，聯(lián)合用藥以增加療效，減少副作用。在經(jīng)藥物作用篩選后1月，細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度仍明顯降低，證明了細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了某種機(jī)制，該機(jī)制可以使腫瘤細(xì)胞耐受阿霉素的殺傷作用，但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)提示：（1）通過適當(dāng)劑量的間歇的持續(xù)的沖擊應(yīng)用抗腫瘤藥物，可以篩選出持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞；（2）膽管癌細(xì)胞在阿霉素作用下，細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥濃度下降，這是腫瘤細(xì)胞在含抗腫瘤藥物的掊養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖的基礎(chǔ)；（3）阿霉素可以影響細(xì)胞的分裂增殖周期。但該結(jié)論尚需今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。
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