力達霉素的分子結構與生物合成范文

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摘要：帶有烯二炔結構發色團的抗腫瘤抗生素力達霉素對腫瘤細胞有極強的殺傷力，是近年來發現的抗腫瘤活性較強的化合物之一，在腫瘤的化學治療方面有良好的應用前景。本文介紹力達霉素的分子結構與生物合成、化學合成、分子作用機制與抗腫瘤活性、單克隆抗體高效偶聯物、組合生物合成等方面研究的最新進展。

關鍵詞：力達霉素烯二炔類抗生素；抗腫瘤

力達霉素(lidamycin，LDM)是從我國湖北省潛江縣土壤分離出的一株放線菌StreptomycesglobisporusC1027代謝產物中篩選出的1個新的大分子蛋白類抗腫瘤抗生素。力達霉素的化學結構中含有烯二炔結構的發色團，是烯二炔類抗生素中重要的成員之一。近兩年來，由于烯二炔類的抗生素化合物分子構成新穎并有極強的抗腫瘤活性，已成為化學、藥理學、分子生物學的研究熱點。目前針對力達霉素的多方面的研究工作已取得的長足進展。現就力達霉素的分子結構與生物合成、化學合成、分子作用機制與抗腫瘤活性、單克隆抗體高效偶聯物、組合生物合成等方面的研究工作成果作一綜述。

1、力達霉素的分子結構與生物合成

力達霉素為新型烯二炔類抗腫瘤抗生素，它由1個輔基蛋白和1個發色團構成。蛋白部分由110個氨基酸組成，含有2個分子內二硫鍵，計算相對分子質量為10500u，蛋白質部分沒有抗腫瘤活性，但對發色團有穩定和保護作用，并攜帶發色團到達腫瘤部位。發色團在抗腫瘤活性中發揮主要作用［1～3］，發色團由1個9元環1，5二炔3烯核心結構與氮氧雜萘甲酸、氨基吡啶核糖和β酪氨酸結合而成(Fig.1中1)。這些結構單元不但參與化合物分子的組成，而且與化合物的生物活性密切相關。借助核磁共振對輔基蛋白及其與發色團的復合物進行結構分析并確定各個結構單位的相對位置，發現芳構化的發色團結合在輔基蛋白結構中的“疏水口袋”處，它們之間的親和性可能來自輔基蛋白“疏水口袋”區氨基酸側鏈與發色團之間形成的靜電和疏水作用［4］。發色團核心的烯二炔結構的生物合成途徑一直是人們關注的焦點。烯二炔結構中首尾相接的乙酸結構單元曾被推測是由不飽和脂肪酸的前體被切割和環化后形成或是通過聚酮合成途徑，由烯二炔聚酮合成酶催化聚線性不飽和聚酮中間產物的生物合成，接著采用一種新穎的環化機制而形成烯二炔核心結構。劉文等［5］運用PCR方法成功地克隆了力達霉素脫氧氨基糖代謝途徑中的dNTP葡萄糖4，6脫水酶基因(sgcA)，并以此為探針，通過基因文庫篩選和染色體步移克隆了完整的生物合成基因簇，發現力達霉素的生物合成起源于聚酮代謝途徑，并確定了基因簇編碼1個烯二炔聚酮合成酶SgcE，排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。除了聚酮合成酶SgcE，劉文等［5］還提出了一系列途徑特異的結構基因分別控制各個結構單元的合成。sgcEsgcE11、sgcI、sgcJ、sgcL和sgcF等16個基因負責烯二炔核心的合成；sgcAsgcA6等7個基因sgcA1sgcA6參與脫氧氨基糖的合成；sgcCsgcC5等6個基因參與β氨基酸的合成sgcDsgcD6等7個基因負責雜萘苯環的合成。通過各自途徑生物合成的這三個結構單元分別在糖基轉移酶(SgcA6)、縮合酶(SgcC5)和酰基轉移酶(SgcD6)的催化作用下，與烯二炔核心結合，構成完整的力達霉素發色團分子。對力達霉素生物合成基因簇中結構基因的研究正在進行中，通過生物信息學的分析、在鏈霉菌中的基因中斷實驗以及利用基因工程手段將結構基因的片段克隆至大腸埃希菌表達載體中并對表達產物進行酶學分析可以確定這些結構基因在力達霉素生物合成中的相關功能，并獲取更多生物合成途徑中有關中間產物和反應步驟的信息。目前已陸續報道了sgcD、sgcA1、sgcC1等結構基因的研究分析結果［6～10］。

2、力達霉素化學合成的研究

在力達霉素的化學結構得到解析后，很多實驗室都進行著有關力達霉素化學合成方面的工作，希望通過化學手段可以合成出活性相當乃至更強的化合物。根據逆合成分析，朱錦桃等［11，12］合成了烯二炔發色團中五元環狀中間體，并在此基礎上合成了發色團中烯二炔單元的開鏈衍生物，但并未得到閉環的烯二炔結構。Inoue等［13，14］在對發色團的結構進行了充分研究之后對發色團的骨架結構和烯二炔的雙環［7.3.0］結構進行了合成。由于輔基蛋白Gly96的H原子參與發色團芳構化后的自身降解，該實驗室還利用同位素氘(D)取代輔基蛋白Gly96的H原子，改造后的輔基蛋白類似物由于動力學同位素的效應減小了發色團結構降解的速率，增加其穩定性［15］。Semmelhack等［16］報道了由甘露糖出發經12步反應合成力達霉素發色團氨基糖結構單元的路線，認為合成反應的關鍵步驟在于C4位的內部N取代從而引入順式氨基以及C5位上烯醇化物的甲基化。

3、力達霉素的分子作用機制與抗腫瘤活性

3.1分子作用機制力達霉素的發色團與DNA小溝相互作用，造成DNA損傷，且有序列特異性，為富含AT的區域。如CTTTT/AAAAG，ATAAT/ATTAT，CTTTA/TAAAG，CTCTT/AAGAG，特別是在GTTAT/ATAAC處［17］，力達霉素與雙螺旋DNA小溝結合后插入DNA中，此時藥物并未引起DNA的斷裂，發色團(Fig.1中1)經MasamuneBergman重排后芳構化轉變成有活性的雙游離基中間體(Fig.1中2)，然后奪取DNA脫氧核糖上的氫原子(Fig.1中3)，在有氧條件下使核糖基團氧化，引起DNA單鏈、雙鏈斷裂或形成無堿基位點；在厭氧條件下DNA互補雙鏈的脫氧核糖自由基與藥物分子共價作用形成DNA的鏈內交聯［18］。在力達霉素切割DNA的過程中自由基中間體的存在可以通過電子自旋共振(electronspinresonance，ESR)技術獲得直接有力的證明［19］。

3.2力達霉素對細胞DNA復制的影響力達霉素不但可以造成DNA斷裂，同時還抑制DNA復制。用力達霉素處理SV40、EB病毒感染的細胞，然后通過研究SV40、EB病毒的DNA觀察力達霉素對細胞DNA可能造成的影響。實驗結果發現力達霉素抑制SV40、EB病毒DNA的復制，低濃度力達霉素抑制DNA復制可能與復制蛋白A(RPA)功能的喪失有關，而在高濃度的力達霉素作用下DNA斷裂產生的片段可以誘導DNA依賴的蛋白激酶(DNAPK)活性增高，使其作為反式作用抑制因子影響DNA的復制［20～22］。

3.3力達霉素引發細胞凋亡、細胞周期阻滯和細胞裂亡宋旭等［23］利用nucleicacidarrays的方法將細胞總cDNA進行膜雜交，可同時檢測出大量基因表達的變化，發現力達霉素改變了HCT28細胞多種凋亡相關基因的表達水平，抑制RhoC的表達，促進TRAF3、DR4、DR5、MCH4、MCH6、TRIP、Apo23、ABLL和STAT1的表達，提示力達霉素可能是通過調節TNF受體家族有關的凋亡信號過程，誘導腫瘤細胞凋亡。用低濃度的力達霉素處理人肝癌BEL7402細胞，力達霉素促進凋亡相關基因cmyc、cfos的表達并抑制在肝細胞癌變中起重要作用的nras基因的表達，同時細胞骨架也發生了明顯的變化，微絲排列更整齊，向正常細胞的微絲形態變化。力達霉素引起腫瘤細胞骨架有關組分的變化可能是其抗腫瘤活性的另一種解釋［24］。有研究表明高劑量力達霉素處理人紅白血病K562細胞引起S期細胞的比例明顯升高，死亡細胞的比例明顯增加，提示力達霉素引起DNA的損傷發生在S周期時，細胞周期檢驗點被激活，進而阻止DNA的復制，同時啟動DNA修復機制，或者誘發細胞凋亡［25］。力達霉素對DNA的斷裂損傷可以引發細胞周期的阻滯，實驗結果顯示力達霉素抑制內皮細胞增殖并誘導細胞凋亡，低濃度的力達霉素可使內皮細胞被阻滯在G/M1期；高濃度的力達霉素誘導細胞凋亡的發生。同時力達霉素改變內皮細胞中與增殖和凋亡相關的基因的表達，下調抗細胞凋亡蛋白Bcl2和PCNA的表達水平。細胞內游離鈣離子濃度也顯著的升高，提示由力達霉素引發的細胞凋亡可能與鈣離子內流或影響鈣離子依賴的下游信號傳導通路有一定關聯［26］。何其揚等［27］報道了力達霉素在BEL7402活細胞內直接切割DNA可形成梯度條帶，并首次觀察到染色質凝集的現象，而在其他烯二炔類抗生素誘導細胞凋亡的研究中均未見報道此現象。現已公認的細胞凋亡后期的共同途徑是caspases(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)的激活。通過測定caspase的活性及與染色質凝集的關系，認為染色質凝集發生的時間早于caspase達到高峰的時間，而少量caspase的活化不足以解釋大量的細胞發生染色質凝集的現象。這一現象提示這種染色質凝集的方式有別于典型的細胞凋亡。力達霉素引起細胞死亡(也被稱為裂亡)的特征有別于典型細胞凋亡，而裂亡的引發可能與力達霉素誘導的細胞有絲分裂的異常(如中心體的過度復制、多極性紡錘體的形成、多核的形成等)有關［28］，力達霉素在HCT116細胞中造成染色體異常并破壞端粒區的功能，這是由于力達霉素誘導的大量雙鏈DNA斷裂引發細胞采取非同源末端結合(NHEJ)方式的修復途徑，導致染色體發生錯誤連接［29］。

3.4力達霉素對腫瘤細胞的抑制作用及實驗治療觀察力達霉素對多種腫瘤細胞具有強烈的殺傷作用，對人肺癌、人鼻咽癌、人胃癌細胞等均有強烈的細胞毒作用。尚伯陽等［30］報道力達霉素對體外培養的肝癌細胞有高度殺傷作用。單核細胞直接細胞毒性測定(MTT)法測定結果表明，力達霉素對人肝癌BEL7402和小鼠肝癌22細胞增生有強烈的抑制作用，抑瘤率呈劑量依賴性。以IC50相比較，力達霉素細胞毒性比絲裂霉素C強10000倍以上。力達霉素對小鼠移植性結腸癌(皮下、盲腸、肝內)生長有明顯抑制作用，對肝轉移也有顯著抑制作用，尤其是對較大轉移灶有更強的抑制作用［31］。力達霉素的對腫瘤的抑制還表現在具有抑制腫瘤血管生成和抗侵襲作用。bFGF是重要的腫瘤血管生成因子，腫瘤生成時，儲存于細胞基質中的bFGF被大量釋放出來，同時腫瘤細胞中bFGF的基因表達及生物合成異常活躍。甄紅英等［32］利用雞胚尿囊膜模型證實力達霉素是很強的血管生成抑制劑。實驗還證明力達霉素對bFGF與其受體結合有明顯抑制作用，提示力達霉素抑制bFGF與受體結合，阻斷bFGF在血管生成過程中誘導內皮細胞的增生和遷移，抑制血管生成、腫瘤生長及抗腫瘤轉移。另有研究顯示，力達霉素對侵襲調節基因的表達可產生一定影響，促進人結腸癌HCT8細胞TIMP21基因的表達，抑制MMP9基因的表達從而抑制IV型膠原酶的產生，同時又誘導金屬蛋白酶抑制因子的產生，表現出抗侵襲活性［33］。力達霉素與其他臨床常用抗腫瘤藥物的聯合應用可以表現出更強的抑癌效果，有實驗觀察到力達霉素可以增強順鉑誘導人肝癌BEL7402細胞凋亡，增強順鉑的抗腫瘤作用。順鉑與力達霉素單用均可使抗凋亡蛋白Bcl2的表達水平降低，而順鉑與力達霉素聯合應用后則強烈抑制Bcl2的表達，幾乎達到檢測不到的水平，提示增效機制可能在于聯合應用降低抗凋亡蛋白Bcl2的表達水平，導致線粒體膜電位降低，破壞線粒體膜的穩定性，線粒體內鈣離子外流至細胞質，進一步誘導細胞凋亡［34］。最近有報道quinacrinenetropsin(QN)的雜交分子與力達霉素共同使用可以顯著增強力達霉素誘導雙鏈DNA斷裂和細胞凋亡的程度，由于QN為DNA結合配體，加入QN后力達霉素可能與之形成異源二聚體后改變了和DNA序列結合的位點特異性，增強了在富含GC的區域，特別是5′AGG3′/3′TCC5′處的切割。因此，對DNA結合配體的研究可能成為增強力達霉素抗腫瘤活性、減小其化療應用中副作用的一條有效途徑［35］。

4、C1027與單克隆抗體高效偶聯物的研究

力達霉素對腫瘤細胞的高效殺傷力使其極有可能成為新型高效抗腫瘤藥物，但是缺乏腫瘤特異性的缺點限制了力達霉素應用于化療。一種行之有效的增強特異性殺傷腫瘤細胞的方法就是將力達霉素作為高效“彈頭”用于研制小型化導向藥物。由于C1027分子構成的特點，可用多種方法將C1027與單抗連接。抗IV型膠原酶單抗3G11與力達霉素的偶聯物3G11LDM與腫瘤細胞H22、HT29、C26呈現出良好的免疫結合活性和較高的抑癌活性。3G11LDM偶聯物通過抗IV型膠原酶單抗3G11攜帶力達霉素到達腫瘤部位實現特異性結合，提高了在腫瘤部位釋放的力達霉素的濃度，使其發揮更強的抑瘤作用［36］。完整的單抗分子與藥物的免疫偶聯物存在分子量大、對實體瘤穿透力差、易產生人抗體抗鼠反應(HAMA)等缺點，近年來設計高效化、小型化的單抗免疫偶聯物也一直成為研究的熱點。例如力達霉素與大鼠抗人肝癌細胞單抗3A5的Fab′片段的偶聯物Fab′LDM，偶聯物比游離力達霉素對靶細胞BEL7402細胞集落生成的抑制作用顯著增強，偶聯物與等劑量游離力達霉素比較，對小鼠移植性結腸癌26細胞顯示出更強和更長時間的抑瘤作用［37］。以IV型膠原酶為治療靶點，制備單抗3G11Fab′片段與力達霉素偶聯的小型化免疫偶聯物對肝癌細胞H22的細胞毒和治療作用較游離力達霉素均有顯著提高［38］。除化學偶聯的方法外，利用基因工程技術將抗體Fv片段和C1027的烯二炔發色團制成分子量僅為387ku的融合蛋偶聯物已獲得成功。這也為利用基因工程進一步進行scFv與烯二炔偶聯的研究奠定了基礎［39］。

5、力達霉素的組合生物合成

通過化學全合成的方法獲得結構復雜的力達霉素及其結構類似物，以促進作用機制和臨床應用的研究雖然已經取得了一定進展，但由于化學結構的高度復雜性，化學全合成力達霉素仍然面臨諸多困難，利用這一手段促進臨床應用的前景也非常有限。作為有機合成的重要補充，近年來發展的組合生物合成技術為復雜天然產物及其類似物的獲得提供了一條生物合成的方法。例如通過增加力達霉素的結構基因拷貝數有可能突破生物合成限速酶的催化瓶頸，使力達霉素的產量在原有基礎上大大提高。力達霉素生物合成基因簇中結構基因和調節基因的克隆和功能的確定也為合理化修飾力達霉素的生物合成途徑和提高產量提供了可能性。力達霉素生物合成途徑的分析顯示β氨基酸結構單元上的C22OH基團是在羥化酶SgcC催化下形成的，通過基因敲除的方法將SgcC失活，獲得了一種失去OH基團的新型力達霉素，該化合物不僅保留了原有的抗腫瘤活性，在沒有輔基蛋白保護的條件下，25℃時穩定性比原化合物至少高出5倍以上［5］。

6、展望

隨著研究的不斷開展，人們對力達霉素以及烯二炔類抗生素的化學結構和生物活性有了越來越深入的了解，力達霉素對腫瘤細胞強大的殺傷力使之有望成為抗癌的一種重要的化學治療手段。目前，力達霉素的藥理學研究已經進入I期臨床。同時，力達霉素為醫藥工作者提供了進行基礎和臨床研究的寬廣領域。只有徹底搞清力達霉素殺傷腫瘤細胞的作用機制并盡可能減小其毒副作用才能使力達霉素廣泛應用于臨床成為可能。力達霉素的生物合成也是一個相當復雜的過程，不但步驟繁多，還需要對代謝網絡的協調控制，對生物合成途徑的闡明將有利于提高力達霉素產生菌的產量，并使力達霉素的結構改造變得簡便易行。對于力達霉素生物合成途徑的研究為我們在基因和生化水平探索天然產物的生物合成機制提供了一個極好的模型，對研究其它烯二炔類抗生素的生物合成提供了極有價值的參考。相信隨著研究的不斷深入，力達霉素和烯二炔類抗生素在腫瘤的化學治療方面將會顯示巨大的作用。