聚酮合酶中模塊的減少范文

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1、聚酮化合物及其聚酮合酶

聚酮化合物是一大類(lèi)由細(xì)菌、真菌和植物將低級(jí)羧酸通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，它包括許許多多具有抑制細(xì)菌(如紅霉素、四環(huán)素)、真菌(如灰黃霉素、兩性霉素)、寄生蟲(chóng)(如avermectin、奈馬克丁)、癌癥(如多柔比星、enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化合物同時(shí)還具有免疫抑制劑的活性(如雷帕霉素、FK506)，它被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、畜牧和農(nóng)業(yè)。如今，這一化合物越來(lái)越為人們所重視，這主要是由于該化合物具有：(1)無(wú)可比擬的生物學(xué)活性使之具有巨大的新藥物開(kāi)發(fā)潛力和商業(yè)價(jià)值，聚酮化合物所形成的藥物已用于幾乎所有重要的疾病治療，每年的銷(xiāo)售額超過(guò)了100億美元；(2)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制為人們研究酶催化的分子機(jī)制、分子識(shí)別和蛋白質(zhì)的相互作用提供了空前的契機(jī)；(3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人們方便地通過(guò)組合生物合成手段來(lái)獲得新的化合物［1］。目前已發(fā)現(xiàn)了不少于10000種聚酮化合物，而由之衍生出的新產(chǎn)物更是難以記數(shù)。聚酮化合物是功能和結(jié)構(gòu)最多樣化的天然產(chǎn)物之一，它們的合成包括酰基輔酶A活化羧酸的一系列重復(fù)的醇醛縮合而形成有一定長(zhǎng)度的聚酮鏈骨架，然后經(jīng)過(guò)環(huán)化或者芳香化、或者與脫氧糖等結(jié)構(gòu)單位連接等過(guò)程。盡管聚酮化合物的結(jié)構(gòu)和特性千差萬(wàn)別，總的來(lái)說(shuō)它可以分為兩大類(lèi)：芳香族聚酮化合物和復(fù)合聚酮化合物。前者是乙酸通過(guò)縮合(起始單位除外)形成的大部分β酮基在酰基鏈的延伸和完成后都一直保持非還原狀態(tài)，經(jīng)過(guò)折疊和醇醛縮合形成六元環(huán)，芳香環(huán)隨后被脫水還原，如放線(xiàn)紫紅素、柔紅霉素、四環(huán)素。復(fù)合聚酮化合物比芳香族聚酮化合物在結(jié)構(gòu)變化上大的多，其構(gòu)成單位有乙酸、丙酸和丁酸等，而且由于與芳香族聚酮化合物在合成化學(xué)、β酮基還原過(guò)程、側(cè)鏈的空間位阻上的本質(zhì)差別，許多不經(jīng)過(guò)折疊和芳香化，而是通過(guò)內(nèi)酯化成環(huán)，還有一部分仍保持酰基鏈，如大環(huán)內(nèi)酯抗生素紅霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和兩性霉素、聚醚類(lèi)抗生素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生蟲(chóng)抗生素avermectin等。聚酮化合物是通過(guò)聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)催化形成的，其催化過(guò)程類(lèi)似于脂肪酸合酶(fattyacidsynthase,FAS)催化的脂肪酸生物合成，即通過(guò)酰基CoA活化的底物之間的重復(fù)脫羧縮合而合成［2，3］，但兩者在合成單位的選擇(包括起始單位和延伸單位)、鏈裝配過(guò)程中每個(gè)酮基還原程度的控制、以及芳香聚酮或復(fù)合聚酮鏈長(zhǎng)的決定等方面也存在著明顯的差異，主要體現(xiàn)在：(1)FAS一般以乙酸作為起始單位，而PKS往往使用不同的起始單位，最為常用的有乙酸、丙酸，此外還有丁酸，殺假絲菌素使用的對(duì)氨基苯甲酸等，而avermectin所利用的起始單位可多達(dá)40余種；(2)FAS一般只用乙酸為鏈延伸單位，而PKS除了利用乙酸作為鏈伸長(zhǎng)單位外，還可利用丙酸或丁酸，在終產(chǎn)物中相應(yīng)生成甲基或乙基側(cè)鏈；(3)PKS可以通過(guò)酮基選擇性地還原和脫水，從而在終產(chǎn)物的相應(yīng)位置形成酮基、羥基、雙鍵或亞甲基等功能團(tuán)，同時(shí)也決定了手性中心的立體化學(xué)構(gòu)型。目前已經(jīng)揭示的聚酮合酶可以分為三類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［4］。研究和報(bào)道最多和較為透徹的是Ⅰ型PKS，它是由幾個(gè)多功能的多肽組成，每一個(gè)多肽上都分別攜帶有參與聚酮生物合成所必需的各種酶的結(jié)構(gòu)域(domain)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域只參與整個(gè)聚酮碳鏈構(gòu)建中的一步生化反應(yīng)(noninterative)，而參與一輪聚酮生物合成反應(yīng)的所有結(jié)構(gòu)域稱(chēng)為一個(gè)合成酶單位(SU,synthaseunit)，編碼這個(gè)合成酶單位的DNA稱(chēng)為一個(gè)模塊(module)。Ⅰ型模塊結(jié)構(gòu)的PKS就猶如在軌道上行駛的一列火車(chē)，在起點(diǎn)由特定的“搬運(yùn)工”――酰基轉(zhuǎn)移酶(acyltransferase,AT)把不同的起始單位裝車(chē)后，通過(guò)“裝配工”――酮脂酰ACP合成酶(ketoacylACPsynthase,KS)經(jīng)過(guò)縮合反應(yīng)將不同的“原料”――羧酸起始或延伸單位進(jìn)行組裝，隨著火車(chē)的運(yùn)行，不斷地從一個(gè)“停靠裝配站”――酰基載體蛋白(acylcarrierprotein,ACP)到下一個(gè)，聚酮鏈也不斷地得到延伸，中途根據(jù)模塊組成的不同和指令要求，在其它不同的“特殊工種裝配工”――脫水酶(dehydratase,DH)、烯醇還原酶(enoylreductase,ER)的作用下相應(yīng)地進(jìn)行還原(形成β羥酯鍵)或脫水(形成α,β烯醇酯鍵)或進(jìn)一步還原(形成飽和的亞甲基)，直至到達(dá)終點(diǎn)，在“裝卸工”硫酯酶(thioesterase,TE)的幫助下，完成最后的工序并將聚酮前體產(chǎn)物從PKS上卸載下來(lái)。這種PKS模塊結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)有其非同尋常的意義。盡管各種聚酮化合物結(jié)構(gòu)各異，PKS模塊的底物特異性決定了I型PKS對(duì)起始單位和延長(zhǎng)單位的選擇，而PKS每個(gè)模塊上還原結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)則使聚酮產(chǎn)物得到不同程度的還原。復(fù)合聚酮化合物結(jié)構(gòu)的多樣性來(lái)自聚酮骨架組成單位的多樣性和每個(gè)碳單位的不同還原程度，這意味著聚酮抗生素的結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的可塑性，故可通過(guò)模塊內(nèi)或模塊間的合理重組，設(shè)計(jì)出新基因(簇)組成或新的生物合成途徑，這也是I型PKS作為組合生物學(xué)主要研究對(duì)象的重要原因之一。Ⅱ型PKS是一個(gè)多功能酶復(fù)合體，只包含一套可重復(fù)使用(interative)的結(jié)構(gòu)域，每一結(jié)構(gòu)域在重復(fù)的反應(yīng)步驟中被多次地用來(lái)催化相同的反應(yīng)，其首次報(bào)道是在1984年［5］。以來(lái)自S.glaucescens的芳香族聚酮化合物tetracenomycinC研究的較多［6］，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了影響鏈長(zhǎng)的兩個(gè)鏈長(zhǎng)決定因子(CLF)KSα和KSβ，但確切機(jī)制仍然不是十分清楚。對(duì)Ⅱ型PKS的研究近年來(lái)也取得了一些進(jìn)展，如Bao等［7］對(duì)柔紅霉素產(chǎn)生菌S.peucetius的研究結(jié)果顯示，dpsC基因決定了生物合成的起始單位，DpsC專(zhuān)一性地使用丙酰CoA為起始單位，一般來(lái)說(shuō)，Ⅱ型PKS的起始單位均為乙酰CoA。另外，Bisang等［8］找到了Ⅰ型PKS和Ⅱ型PKS的鏈長(zhǎng)因子之間的共同點(diǎn)，這是Ⅰ型和Ⅱ型PKS有機(jī)聯(lián)系的一個(gè)切入點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型PKS的KSQ(被認(rèn)為可能是Ⅰ類(lèi)PKS的鏈長(zhǎng)因子)及Ⅱ型PKS的CLF和Ⅰ型PKS的KS結(jié)構(gòu)域類(lèi)似，惟一的區(qū)別是KS的活性中心殘基半胱氨酸被高度保守的谷氨酰胺代替，這個(gè)氨基酸對(duì)這一結(jié)構(gòu)域的脫羧酶活性以及聚酮化合物的合成具有重要的作用。和Ⅰ型PKS相比較，Ⅱ型PKS在起始單位和延長(zhǎng)單位的選擇方面變化不大，所以它的結(jié)構(gòu)多樣性主要是來(lái)自于聚酮合成后的修飾步驟。1999年，日本東京大學(xué)的Funa等［9］發(fā)現(xiàn)了一種類(lèi)似苯基苯乙烯酮合成酶的PKS(chalconesynthaselikePKS)――RppA，后來(lái)被稱(chēng)為Ⅲ型PKS。RppA是一個(gè)在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的與芳香族聚酮化合物苯基苯乙烯酮合成相關(guān)的酶，它是一種同二聚體酶并可重復(fù)進(jìn)行縮合反應(yīng)(interative)，催化芳香族聚酮化合物淡黃霉素(flavolin)生物合成。催化苯基苯乙烯酮(許多黃酮類(lèi)化合物的前體物)形成的苯基苯乙烯酮合成酶被認(rèn)為是植物所特有的，然而來(lái)自S.griseus的rppA基因所編碼的一個(gè)372個(gè)氨基酸的蛋白卻與苯基苯乙烯酮有著很大的同源性，它以丙酰CoA作為起始物，進(jìn)行4個(gè)延伸反應(yīng)將五肽釋放和環(huán)化成為1，3，6，8四羥基萘(THN)，THN將會(huì)被氧化成淡黃霉素，然后聚合成各種有色的化合物。由RppA催化合成的THN不僅是黑色素還是各種含萘醌環(huán)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的中間產(chǎn)物。Ⅲ型PKS和其它兩種PKS迥然不同，它們不依賴(lài)于作為酰基載體的ACP及其上的4′磷酸泛酰巰基乙胺。Ⅰ型和Ⅱ型PKS常常通過(guò)ACP活化酰基CoA的底物，而Ⅲ型PKS直接作用于酰基CoA活化的簡(jiǎn)單羧酸。盡管結(jié)構(gòu)和機(jī)制不相同，但所有類(lèi)型的PKS都是通過(guò)酰基CoA的脫羧縮合和KS結(jié)構(gòu)域或亞基催化CC鍵的形成。在進(jìn)化關(guān)系上Ⅲ型PKS與其它PKS及已知的FAS也相距甚遠(yuǎn)。在過(guò)去的十年里，隨著生物合成基因簇克隆方法學(xué)的創(chuàng)新以及DNA測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展和研究成果的不斷積累，人們對(duì)于PKS的認(rèn)識(shí)越來(lái)越全面，也越來(lái)越深入，但人們不禁還是想知道我們究竟對(duì)PKS了解多少？如今越來(lái)越多的報(bào)道顯示Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS并不能完全囊括不斷涌現(xiàn)出的新的聚酮合酶［4］。從結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，有些Ⅰ型PKS的結(jié)構(gòu)域也可以是被重復(fù)使用的，如AviM、CalO5、NcsB、SgcE和CalE8等；有些Ⅱ型PKS的結(jié)構(gòu)域也可以是不能被重復(fù)使用的，如NonJKPQU；有些PKS似乎是Ⅰ型PKS和Ⅱ型PKS的雜合體，如LnmIJ/LnmG和PedFG/PedCD。從機(jī)制的角度來(lái)看，有些PKS依賴(lài)ACP，而有些PKS不依賴(lài)ACP。從合成的角度來(lái)看，有些PKS即可以催化形成CC鍵，也可以催化形成CO鍵，如NonJK。也許，我們眼前所發(fā)現(xiàn)和利用的PKS只是整個(gè)PKS龐大家族中的小小一員，更多更精彩的內(nèi)容正等待人們?nèi)ソ沂尽?/p>

2、聚酮合酶的組合

生物合成自從以英國(guó)約翰英納斯中心(JohnInnesCentre)的DavidAHopwood為先驅(qū)的研究人員在鏈霉菌模式菌種――天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)中建立和發(fā)展遺傳操作系統(tǒng)以來(lái)，鏈霉菌的分子遺傳學(xué)一直成為國(guó)際生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)三十年廣泛而深入的研究，其中抗生素生物合成基因的克隆在抗生素領(lǐng)域已產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。首先，這些基因的克隆和測(cè)序使我們對(duì)抗生素的特征有了新的認(rèn)識(shí)，例如，對(duì)抗生素生物合成基因成簇排列規(guī)律的發(fā)現(xiàn)極大地幫助了新基因簇的克隆和分析。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)使人們對(duì)抗生素有了更深入的了解的第二個(gè)方面是對(duì)聚酮類(lèi)抗生素的認(rèn)識(shí)。已知抗生素結(jié)構(gòu)種類(lèi)繁多，然而它們當(dāng)中的最龐大的一類(lèi)，包括大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、聚醚類(lèi)、多烯類(lèi)、蒽環(huán)類(lèi)等都是通過(guò)聚酮合酶途徑合成的，聚酮鏈合成的底物選擇、還原程度和產(chǎn)物的立體化學(xué)構(gòu)型都是由PKS上相應(yīng)模塊中的結(jié)構(gòu)域決定的，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能都一一對(duì)應(yīng)在最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)上，這種多功能模塊化PKS中催化活性中心和化學(xué)合成步驟及終產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，使得通過(guò)編輯生物合成基因來(lái)設(shè)計(jì)雜合產(chǎn)物成為可能，并由此產(chǎn)生出一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域――聚酮合酶的組合生物學(xué)。聚酮合酶的組合生物學(xué)就是通過(guò)基因工程等相關(guān)技術(shù)人為地對(duì)產(chǎn)生抗生素等微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑進(jìn)行合理的改造，由此產(chǎn)生非天然的雜合基因或基因簇，從而形成新的非天然的天然聚酮化合物，與傳統(tǒng)組合化學(xué)的主要區(qū)別是它是在基因水平上由微生物來(lái)合成自然界原本并不存在的新化合物，而且這種化合物的數(shù)量是驚人的。可以從理論上來(lái)推算一下通過(guò)聚酮合酶的組合生物學(xué)所衍生的聚酮化合物的潛力(CP,combinatorypotential)［10］。CP=ATL［ATE×4］MATL代表負(fù)責(zé)加載不同起始合成單位的AT結(jié)構(gòu)域；ATE代表負(fù)責(zé)加載不同延伸合成單位的AT結(jié)構(gòu)域；4代表由β酮基的經(jīng)不同結(jié)構(gòu)域催化形成產(chǎn)物的可能性；M代表基因簇中模塊的數(shù)目。這還不包括AT兩種立體化學(xué)可能性、KR結(jié)構(gòu)域兩種立體化學(xué)可能性、加尾酶等其它可能增加產(chǎn)物數(shù)量可能性的因素。以一個(gè)像紅霉素這樣典型的包含6個(gè)模塊的PKS基因簇為例，若含有3種類(lèi)型的AT(識(shí)別加載丙二酰CoA，甲基丙二酰CoA，乙基丙二酰CoA)，那么可能形成的聚酮化合物的理論值就接近10000000，這就為聚酮庫(kù)的建立奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。縱覽聚酮合酶特別是Ⅰ型PKS組合生物學(xué)近十年來(lái)的發(fā)展，歸納起來(lái)采用技術(shù)有如下幾種［11～32］。

2.1聚酮合酶中模塊的減少聚酮鏈的構(gòu)成單位與催化它形成的PKS模塊是一一對(duì)應(yīng)的，因此，聚酮鏈的長(zhǎng)度可以通過(guò)改變延長(zhǎng)單位模塊的數(shù)目來(lái)完成，前提是最后一個(gè)模塊和環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域必須能夠識(shí)別非天然的中間產(chǎn)物。如前所述，在紅霉素PKS中，除了融合于模塊1中的兩個(gè)起始加載結(jié)構(gòu)域(ATL和ACPL)和模塊6中的TE結(jié)構(gòu)域外，有六個(gè)鏈延伸模塊分別位于DEBS1、DBS2和DEBS3中，紅霉素合成過(guò)程中內(nèi)酯環(huán)的大小由DEBS中模塊數(shù)決定，利用基因工程方法重新調(diào)整TE的位置，使TE重新和一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或五個(gè)DEBS模塊組合，結(jié)果產(chǎn)生了新的截短了的PKS，并合成了預(yù)期的二酮、三酮、四酮和六酮化合物，除二酮外，其它的幾個(gè)聚酮化合物都以?xún)?nèi)酯環(huán)形式存在［18，33～36］(圖1)。這些實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)化酶具有較廣的底物特異性，它的重新定位可以產(chǎn)生各種鏈長(zhǎng)的聚酮。

2.2聚酮合酶中模塊的增加在基因中添加模塊直至2001年才獲得成功。Rowe等將來(lái)自S.hygroscopicus合成雷帕霉素PKS的模塊2、模塊5分別插入截短的DEBS1TE模塊1和模塊2之間，合成了在相應(yīng)位置多出一個(gè)結(jié)構(gòu)單位的四酮化合物；將雷帕霉素PKS的模塊2、模塊5分別插入全長(zhǎng)DEBS的模塊1和模塊2之間，則合成了多出一個(gè)結(jié)構(gòu)單位十六元環(huán)的聚酮化合物［36］(圖2)。

2.3聚酮合酶中模塊的替換在紅霉素DEBS1模塊1的N端，存在兩個(gè)起始加載結(jié)構(gòu)域(ATL和ACPL)，它們負(fù)責(zé)紅霉素合成第一步反應(yīng)――6dEB生物合成起始物丙酰CoA的選擇和加載，因此這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域也被稱(chēng)為起始加載模塊(loadingmodule，LM)。已知不同的起始加載模塊對(duì)底物的選擇性不同，avermectin的起始加載模塊對(duì)起始物要求非常寬松，它可加載多達(dá)40余種不同化合物作前體［37］。Marsden用avermectin的起始加載模塊取代紅霉素的起始加載模塊構(gòu)建的糖多孢紅霉菌突變體，通過(guò)添加不同的前體合成了新的C13位為異丙基、2丁基等紅霉菌A、B和D衍生物［38］(圖3)。Pfeifer用來(lái)源于合成利福霉素的起始加載模塊替換紅霉素的起始加載模塊也合成了在C13位結(jié)合苯環(huán)的紅霉菌衍生物［39］(圖3)。

2.4模塊中結(jié)構(gòu)域的減少關(guān)于PKS基因工程改造的第一例成功的報(bào)道就是對(duì)紅霉素PKS模塊5中KR結(jié)構(gòu)域的缺失失活。在紅霉素PKS模型提出時(shí)，為驗(yàn)證模型的正確性，Donadio等通過(guò)同源重組同框缺失DEBS3中模塊5的KR5結(jié)構(gòu)域的80個(gè)氨基酸，正如預(yù)料的那樣，突變體合成了新的在C5位是酮基的紅霉素衍生物5，6dideoxy3αmycarosyl5oxoerythronolideB［39］(圖4)。這不僅證實(shí)了6dEB生物合成模型的正確性，還給人們以極大的啟示：在DEBS中結(jié)構(gòu)域的功能和結(jié)構(gòu)是相對(duì)應(yīng)的；DEBS以及6dEB后修飾酶對(duì)底物的要求并不十分嚴(yán)格，突變產(chǎn)生的中間產(chǎn)物能被下游的結(jié)構(gòu)域有效的加工利用。另一個(gè)類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)是針對(duì)DEBS2模塊4中烯酰基還原酶結(jié)構(gòu)域(ER4)的功能失活，它衍生的大環(huán)內(nèi)酯中C6C7由單鍵變成了雙鍵［40］(圖4)。此外，還有一些關(guān)于使結(jié)構(gòu)域功能喪失的成功報(bào)道，但主要是集中于與還原功能有關(guān)的KR、ER、DH結(jié)構(gòu)域，這是因?yàn)樗鼈儧Q定了相應(yīng)碳單位不同的還原程度，通過(guò)改變?chǔ)峦倪€原程度可以產(chǎn)生更多的雜合聚酮。

2.5模塊中結(jié)構(gòu)域的增加β酮基的還原程度不但影響聚酮碳骨架的多樣性，而且影響內(nèi)酯化的方式和以羥基為中介進(jìn)行的其A：紅霉素全長(zhǎng)DEBS；B：只包含模塊1、2和TE結(jié)構(gòu)域的截短了的紅霉素DEBS；C：只包含模塊1、2、3和TE結(jié)構(gòu)域的截短了的紅霉素DEBS；D：只包含模塊1、2、3、4、5和TE結(jié)構(gòu)域的截短了的紅霉素DEBS圖1聚酮合酶中模塊減少示意圖A：只包含模塊1、2和TE結(jié)構(gòu)域的截短了的紅霉素DEBS；B：在截短了的紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個(gè)來(lái)自雷帕霉素PKS的模塊2(灰色區(qū))；C：在截短了的紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個(gè)來(lái)自雷帕霉素PKS的模塊5(灰色區(qū))；D：紅霉素全長(zhǎng)DEBS；E：在全長(zhǎng)紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個(gè)來(lái)自雷帕霉素PKS的模塊2(灰色區(qū))；F：在全長(zhǎng)紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個(gè)來(lái)自雷帕霉素PKS的模塊5(灰色區(qū))它官能團(tuán)與聚酮的結(jié)合。KR結(jié)構(gòu)域的增加或KRDH結(jié)構(gòu)域的增加或KRDHER結(jié)構(gòu)域的增加，都有可能影響β酮基的不同程度的還原而改變其它基團(tuán)連接以及改變內(nèi)酯環(huán)化的位點(diǎn)。McDaniel等將紅霉素PKS的模塊2的KR替換為來(lái)自于雷帕霉素PKS的模塊4的DHKR，相當(dāng)于模塊2比原來(lái)多增加了一個(gè)DH結(jié)構(gòu)域，使原有的羥基發(fā)生了脫水，形成了C=C雙鍵［16］(圖5)。同樣，Kao等將DEBS模塊2的KR替換為雷帕霉素PKS模塊l的DHERKR也得到了一個(gè)新的八元環(huán)化合物。用來(lái)自雷帕霉素PKS的模塊4的DH4KR4雙結(jié)構(gòu)域(灰色區(qū))替換只包含模塊1、2、3和TE的截短了的紅霉素DEBS的KR2結(jié)構(gòu)域。

2.6模塊中結(jié)構(gòu)域的替換不同PKS模塊選用不同的聚酮鏈延伸單位，延伸單位的選擇是由每個(gè)模塊的AT結(jié)構(gòu)域控制的，AT結(jié)構(gòu)域的替換也可以導(dǎo)致新的聚酮化合物的產(chǎn)生［41］，例如，用RAPS模塊2中具有丙二酰CoA特異性的AT2替代DEBS1TE中模塊1中具有甲基丙二酰CoA特異性的AT1，產(chǎn)生了預(yù)期的兩個(gè)新的三酮內(nèi)A：只包含模塊1、2和TE結(jié)構(gòu)域的截短了的DEBS；B：將avermectin的起始加載模塊(灰色區(qū))取代紅霉素的起始加載模塊；C：紅霉素全長(zhǎng)DEBS；D：將利福霉素的起始加載模塊(灰色區(qū))取代紅霉素的起始加載模塊圖4聚酮合酶模塊中結(jié)構(gòu)域減少示意圖圖5聚酮合酶模塊中結(jié)構(gòu)域增加示意圖酯，這兩個(gè)新產(chǎn)物在內(nèi)酯環(huán)的C4位都缺少了一個(gè)甲基［42］。在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用丙二酰CoA特異性的三個(gè)異源AT結(jié)構(gòu)域來(lái)替代甲基丙二酰CoA特異性的DEBSAT1或AT2結(jié)構(gòu)域，也產(chǎn)生了新的紅霉素衍生物。Lin等第一次嘗試在全長(zhǎng)的PKS中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的替換，他們將紅霉素PKS模塊6的甲基丙二酰專(zhuān)一性AT替換成來(lái)自于雷帕霉素PKS模塊2的丙二酰專(zhuān)一性AT，結(jié)果在產(chǎn)物中產(chǎn)生在C2位缺少一個(gè)甲基側(cè)鏈的新化合物(圖6)。在6dEB的立體結(jié)構(gòu)中，其羥基有S和R兩種構(gòu)型，而羥基的構(gòu)型由相應(yīng)模塊中的KR酶域決定，通過(guò)替換KR酶域可以改變6dEB的立體結(jié)構(gòu)。例如用雷帕霉素KR2替換紅霉素DEBS3中的KR6合成了3位羥基差向異構(gòu)的6dEB衍生物［22］。

2.7前體指導(dǎo)下的新聚酮化合物的合成除上述方法外，還可用破壞PKS模塊1的KS結(jié)構(gòu)域活性，再通過(guò)添加適當(dāng)前體合成新的聚酮化合物［43，44］。Jacobsen等嘗試了用不同前體產(chǎn)生化合物的構(gòu)想［44］，他們首先獲得了紅霉素合成途徑中第一步縮合步驟被阻斷的突變株，然后再通過(guò)外加不同的人工合成的小分子化合物，得到不同的聚酮化合物(圖7)。

3、展望

自1990和1991年英國(guó)劍橋大學(xué)的PeterLeadlay和美國(guó)Abbott實(shí)驗(yàn)室的LeonardKatz在紅霉素生物合成途徑中第一次揭示基因和酶所具有的模塊特征以來(lái)［45，46］，通過(guò)遺傳工程對(duì)模塊PKS基因進(jìn)行可預(yù)測(cè)的人工改造已被各國(guó)研究人員所證實(shí)，利用模塊或結(jié)構(gòu)域增加、減少、替換等多種組合生物學(xué)手段設(shè)計(jì)和改造基因簇，形成一系列非天然的天然性化合物，在藥物創(chuàng)新方面取得了一系列突破，這種突破不僅具有其重要的基礎(chǔ)理論的價(jià)值，也具有潛在的應(yīng)用前景，但仍然存在許多未解之謎和艱難挑戰(zhàn)值得人們進(jìn)行更深入研究和探索。一個(gè)重要的挑戰(zhàn)就在于盡管目前人們可以有的放矢地對(duì)PKS模塊或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因的定向操作，但要面臨和解決的問(wèn)題是這些發(fā)生了生物合成途徑變化所產(chǎn)生的新的結(jié)構(gòu)中間體如何被下游的模塊或結(jié)構(gòu)域或后修飾基因所“一視同仁”予以接納而發(fā)揮作用？這直接影響整個(gè)流水線(xiàn)的順利運(yùn)轉(zhuǎn)和最后產(chǎn)量。隨著人們的努力，越來(lái)越多的呈模塊結(jié)構(gòu)的聚酮生物合成途徑被發(fā)現(xiàn)，但仍然還不清楚哪些模塊或結(jié)構(gòu)域必須存在于同一個(gè)多肽中才能發(fā)揮作用？哪些模塊或結(jié)構(gòu)域可以以單個(gè)蛋白的形式來(lái)發(fā)揮功能？在這樣一條裝配線(xiàn)上，如果可以裝配的單個(gè)部件越多，那么可以想象通過(guò)排列組合所形成的產(chǎn)品的種類(lèi)就越豐富。盡管如此，某個(gè)改造的特定的生物合成途徑目前只能產(chǎn)生一個(gè)或少數(shù)若干個(gè)新的產(chǎn)物，它仍然屬于低通量，還無(wú)法“隨心所欲”、“輕而易舉”地產(chǎn)生一整套包含多個(gè)不同突變的PKS，從而一次性地獲得結(jié)構(gòu)特定而且種類(lèi)繁多的新的聚酮化合物庫(kù)，這還有待于人們對(duì)聚酮中間物在PKS不同模塊之間轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律的深入揭示。此外，許多聚酮化合物在合成的初期往往是沒(méi)有生物學(xué)活性的，只有當(dāng)其從PKS裝配線(xiàn)上釋放下來(lái)后經(jīng)過(guò)一系列不同的后修飾，如氧化、糖基化等過(guò)程才最終完成。因此，這也為通過(guò)組合生物合成創(chuàng)造新產(chǎn)物提供了機(jī)會(huì)，例如可以通過(guò)改造和替換相應(yīng)的后修飾基因來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物創(chuàng)新。除了對(duì)現(xiàn)有基因的人為改造之外，人們還在繼續(xù)從自然界中尋找更多、結(jié)構(gòu)更新穎、活性更特別的新的“原材料”，在這些新的原材料發(fā)現(xiàn)的同時(shí)，也可能伴隨著新的生物合成途徑的揭示，這無(wú)疑也為新的非天然“天然產(chǎn)物”的創(chuàng)造帶來(lái)新的設(shè)計(jì)藍(lán)圖。另一個(gè)挑戰(zhàn)來(lái)自于從技術(shù)和應(yīng)用的角度可用于聚酮化合物高效表達(dá)的宿主系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用。