微衛星DNA在醫學中的作用范文
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當DNA上的多態性順序與某一位點(常用在致病位點)連鎖時,我們便可利用其作為一種標記物,進行遺傳缺陷的產前診斷、雜合子攜帶者的鑒定以及親子鑒定、群體研究等。遺傳標記的發展大致可以分為RFLP、VNTR(主要指小衛星DNA)、微衛星DNA3個階段。1978年Kan和Dozy第1次發現限制性片段長度多態性(RFLP)并用于鐮刀形細胞貧血癥的診斷。1980年Bostein等預言有可能利用分布在整個基因組中的RFLP作為連鎖研究的遺傳標記。但RFLP酶切片段在人群中的高頻率雜合子往往較難發現,在基因組中的多態程度往往也較低,這就限制了其應用。小衛星DNA是RFLP之后的又一類多態性遺傳標記。它首先由Wyman和While在篩選人類基因文庫時發現,隨后Bell等又在人胰島素基因上游363bp處發現一種小衛星DNA。它也具有種類多,分布廣,高度多態等特點,作為一種遺傳標記,它比RFLP更具有應用價值。1989年Litt和Weber等兩個研究小組分別用PCR證明一種(CA)/(GT)的二核苷酸串聯重復順序具有高度的多態性[4,5];隨后Edwards等又發現了三核苷酸和四核苷酸串聯重復順序的多態性[6],人們稱這種串聯重復順序為微衛星DNA,從符合遺傳標記的高度多態,雜合性高,突變率低等標準來說,微衛星DNA比小衛星DNA更優越;且在方法上由于微衛星DNA長度較短,更適合于PCR擴增。1991年“冷泉港基因組作圖和序列分析會議”提出了對微衛星DNA研究的重視和投入。盡管人們首先發現的是二核苷酸微衛星DNA,但現在人們正把目光越來越多地投向三核苷酸微衛星DNA和四核苷酸微衛星DNA,三核苷酸微衛星DNA和四核苷酸微衛星DNA也顯示出二核苷酸微衛星DNA那樣的多態性,但更易檢測,且電泳圖譜上沒有二核苷酸微衛星DNA常常產生的復合帶紋[原因是DNA雙鏈在變性膠上解開,含(AC)重復的鏈與含(TG)重復的鏈移動速率不同]。Edwards等研究表明三聯和四聯重復順序比二聯重復順序變異性更高且擴增更忠實,且發現只有三聯重復順序可能存在于編碼區,如他們發現(AGC)重復順序存在于人雄激素受體基因和果蠅切跡基因的蛋白質編碼區[6]。目前三聯與四聯重復順序的不穩定性與人類疾病的關系正越來越多地引起人們的注意。
2.1微衛星DNA與基因定位和基因組研究基因定位最早是在實驗動植物中進行的。1911年Wilson利用連鎖分析第一次將色盲基因定位在X染色體上。但是運用連鎖分析定位孟德爾遺傳式疾病的致病基因以及連鎖圖譜的完成需要高效標記的獲得,長期以來由于缺少一種既具高信息量又均勻分布的標記,連鎖圖譜一直是項費力費時的工作。遺傳標記的多態性信息量(PIC)是指某一家系可以利用某一多態性位點或單體型作為遺傳標記進行基因連鎖分析的概率,通過PIC可以衡量一個多態性位點的好壞。一個好的多態性位點應具有的特性是:檢測方法簡單可行;與被檢測的致病位點盡可能近,即緊密連鎖;各等位基因在群體中的頻率盡可能高,即有較高的雜合度,使被測個體在該位點盡可能為雜合子。微衛星DNA多態性的發現使基因組的遺傳圖譜工作進入了一個新的階段,并且使疾病基因的定位也更容易。其原理是:對特定染色體上的特定遺傳標記進行PCR擴增,首先將其連鎖到染色體某一區帶然后依次減小到物理距離,這些標記也可用于YAC物理圖譜以及遺傳圖譜與物理圖譜的相互關系上。微衛星DNA的擴增片段一般在100～500bp,在聚丙烯酰胺順序膠上可達到一個堿基的分辨率。用微衛星DNA作標記可使人類遺傳性疾病基因的定位能在半年甚至更短的時間內就能完成,并且隨著標記的增多,連鎖距離能被減小到幾個厘米。這種進展在其它哺乳動物,如大鼠和小鼠中也得到實現。Murry等用微衛星標記構建了人的高分辨全基因組圖譜,篩選出500個GATA類的克隆,15個CEPH家族的標記定出了基因型,而且將基因型信息不斷加入遺傳圖中。Wilsondisease(WND)是一種常染色體隱性遺傳病,Bowcock等將疾病相關基因定位在D13S31與D13S59之間,并且構建了一個YAC,長約4.5mb,包括9個高度多態的微衛星標記,D13S31與D13S59也在其中[7]。到目前為止,微衛星DNA在應用上最成功的例子要數人和小鼠基因組高密度連鎖圖譜的完成[8]。《Science》1994.9報道:經過3個發掘微衛星DNA的團體和110個CEPH合作者的努力,已經完成了一個完整的連鎖圖譜,它包括5840個位點(其中970個為單一順序),涵蓋4000個cM;在這些位點中,3617個為微衛星標記,427個為基因,平均每0.7個cM就有一個標記。這一成功為物理圖譜的完成做了很好的準備,達到了人類基因組工程的第一個目標。有研究表明,在所有已完成的人群多態性研究中,Y染色體表現出相當低的多態性,迄今為止發現的微衛星位點僅為10個左右,但是Y染色體連鎖的多態性位點在進化研究中卻有其獨特地位,原因在于其父系遺傳方式和無重組現象[9]。另外對于微衛星DNA的研究也要注意一個問題:即突變頻率有時是不可忽略的;這種突變率在不同標記間是不同的,估計在10-5～10-3之間,某些標記可能更高一些,這在連鎖不平衡研究和其他非參數分析中必須考慮到,尤其在等位基因頻率計算中要注意。此外微衛星DNA的多樣性在非洲人中是最高的,這與其他遺傳標記正好相反,但是卻支持了非洲起源的假說[10]。
2.2微衛星DNA與遺傳性疾病及腫瘤大量實驗表明微衛星DNA重復單位數目的不穩定性與一些人類遺傳性疾病有關,到目前為止已發現有8種相關的疾病,屬于CGG/CCG重復的有:脆性X綜合征、Fraxe綜合征;屬于CAG/CTG重復的有:重癥肌無力(DM)、X連鎖的脊柱和延髓肌萎縮(X-linkedspinalandbul-barmuscularatrophy)、脊髓與小腦運動失調-Ⅰ型(Spinocerebellarataxiatype-1,SCA1)、Huntington舞蹈征、齒狀核與蒼白球萎縮征(Dentatorubral-palli-doluysianatrophy)、Machado-Joseph綜合征。在脆性X綜合征中,FMR1gene中的(CGG)順序在正常人中的重復次數少于60次,攜帶者60～100次,而發病者則多于100次[11]。Huntington舞蹈癥的突變基因中(CAG)重復次數往往超過35次,Andrew等證明擴展的(CAG)序列在通過種系的傳遞過程中是不穩定的[12]。而對于MJD,在MJD基因(14q32.1)中的(CAG)重復次數在正常人為12～37次,而發病者為62～84次,并且發現男性比女性變異大[13]。Richard和Southerland稱這種不穩定的突變為動態突變,突變情況和重復單位數目有關,且突變體往往具有和前一輩不同的突變頻率。最近發現的微衛星DNA與腫瘤的密切關系更引起了人們的極大興趣。Peltomaki發現了遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)與微衛星DNA的密切關系。作者一共用了345個微衛星標記進行篩查,發現HNPCC基因與D2S123標記緊密連鎖,并且大多數HNPCC腫瘤中的D2S123片段電泳泳動速率與正常組織中的片段不同,在D2S123標記兩側的D2S119、D2S147以及其他染色體上的某些標記片段也有電泳速率的改變,說明各標記片段長度有變化。這種微衛星不穩定現象發現存在于HNPCC腫瘤中,但在散發性腫瘤中非常少見[14]。此外Thibodean等在對90例結直癌研究中也發現微衛星不穩定現象,變化程度為從2bp到大片段的缺失或擴增[15]。因為子宮內膜癌常與HN-PCC關聯,Burks等研究了30例子宮內膜癌患者,發現7例(23%)表現微衛星不穩定現象,作者認為這種遺傳上的變異可能是此類腫瘤在發生上的重要特征。Ionov則發現12%的結直腸癌在(AT)順序和其他簡單串聯重復順序上存在缺失,作者認為這種突變可能反映了結腸的癌變是由于DNA復制或修復的不忠實造成[16]。近來利用微衛星DNA對乳腺-卵巢癌的研究大大增多,研究首先是用許多微衛星標記對患者家系進行連鎖分析,將疾病相關基因定位于17q21,命名為BRCA1[17,18],現已經發現最常見的BRCA1突變是第2個外顯子中一個2bp的缺失[19]。
2.3個體識別Southern雜交技術和大量VNTRs位點的發現使DNA作圖廣泛應用到個體識別上,于是VNTR很快取代了以往的HLA分型。現在又發展到應用微衛星DNA來進行個體識別。其優點在于快速、簡便、所需DNA量少,相比較Southern分析,只需要其1/10～1/100量的DNA,來自粗血溶解物或濾紙上的一點血跡就可以進行分析,這一特點大大適用于法庭分析,因為這種情況下往往不可能得到完整的高分子量DNA。在操作方法上可以使用多重PCR來簡化分析,引物設計在24bp左右,(GC)含量約為50%,因此所有擴增反應都有相近的溶解溫度,可以一次同時進行。Alford等利用9個微衛星標記做了50例親子鑒定,準確率達99.73%[20]。Hammond等用13個不相連鎖的微衛星標記對4組人群進行了分析,并且證明可以用在解決實驗室樣品的混淆、骨髓移植、親子鑒定、性襲擊以及各種刑事鑒定中[21]。有些學者還利用了微衛星DNA對某些古代人的遺跡進行分析,這在考古學方面顯然是一個新的應用,但要避免樣品的混淆和真偽問題。此外目前應用在個體識別上的建立在PCR基礎之上的方法也尚有不足:(1)大多數微衛星標記的變異是有限的,平均雜合度小于70%～80%,因此往往需要超過9個(可能要18個)位點才能起到作用;(2)易受近親繁殖和人群結構的影響。Pena認為目前的檢驗方法若配合多位點的微衛星探針(MLP)或恰當數目的單位點探針(SLP)會更有效[22]。