腦細胞間液藥理學的研究范文

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腦細胞間液（Braininterstitialfluid,BIF）又稱腦細胞外液（Cerebralextracellularfluid,CEF），是存在于腦神經細胞之間的體液。它是神經元生存的直接外環境，也是腦靶向藥物成分透過血腦屏障作用于神經細胞的主要途徑，腦細胞間液中包涵了神經元和膠質細胞釋放到胞外的內源性物質，是檢測入腦藥物成分的理想對象。基于上述理念，本課題組提出腦細胞間液藥理學的研究思路，采用微透析技術收集腦細胞間液，檢測其中藥物有效成分和內源性成分如神經遞質等的變化，并研究其對細胞或組織等模型的藥效和作用機制。腦細胞間液藥理學用于腦保護中藥復方的有效物質篩選和機制研究，具有重要的意義和明顯的優勢。

一、腦細胞間液藥理學的概念

自田代真一等[1]首次提出“血清藥理學”的概念以來，逐漸形成了應用此種方法研究中藥藥理的趨勢。但由于血腦屏障將大腦與外周嚴格區分，從而致使神經細胞的微觀生存環境和屏障以外的其它體細胞有很大差別。首先，血清藥物成分與能進入腦組織中的藥物成分也存在較大差異。血腦屏障控制著物質的轉運，保證中樞神經系統內環境的高度穩定。完整的血腦屏障是一個復雜的細胞系統，由血管內皮細胞、星形膠質細胞、周細胞、神經元和細胞外基質共同構成，這一特殊結構可使血液中多種溶質從腦毛細血管選擇性的進入腦組織。

其中，內皮細胞間的緊密連接、基底膜及星形膠質細胞的終足形成了BBB的3道機械屏障，而轉運系統和藥物代謝酶構成了其酶屏障。水溶性藥物受到機械屏障的阻止，不能進入血腦屏障。脂溶性藥物的跨膜轉運受血腦屏障表面的多種轉運體控制，轉運體的表達受癲癇或炎癥等因素影響，間接影響到脂溶性藥物成分的透過率[2，3]。

其次，血清和腦細胞間液的基質物質不同。從該層意義上來講，將含藥血清用于神經元的培養并不恰當，已有實驗證明含藥血清對神經細胞有毒害作用[4]。所以，腦保護藥物研究不適用血清藥理學的方法，只能尋求其它手段。梅建勛等[4]提出腦脊液藥理學的概念，采用正常家兔給予受試中藥，然后從小腦延髓池穿刺采集腦脊液，用于神經細胞培養。結果顯示，含藥腦脊液有一定的神經營養作用。由于腦脊液與腦細胞間液存在交換，研究腦脊液中化學物質的變化，一定程度上可以反應血腦屏障通透性的變化[5]，但不同藥物在腦脊液與腦細胞間液中的藥物濃度存在差距。LiuX等[6]分別采用微透析法和抽取腦脊液的方法，檢測了戊硫代巴比妥、9-羥利培酮等9種藥物在腦細胞間液和腦脊液中的含量，結果9-羥利培酮在腦脊液中的濃度是微透析液濃度的5倍，其余8種藥物腦脊液中濃度均在微透析液濃度的3倍以內，證明腦脊液中藥物成分也有異于腦細胞間液。血-腦脊液屏障位于腦室脈絡叢的血液與腦脊液之間，其結構基礎主要是脈絡叢上皮細胞之間有閉鎖小帶相連，與血-腦屏障相比結構疏松，存在滲漏的小孔，故腦脊液與血液間存在豐富的物質交換。進入腦脊液的小分子示蹤劑按時間順序依次在血管、毛細血管、引流靜脈和腦細胞間液中被檢出，這證明腦脊液與腦細胞間液的交換相比血液與腦脊液的交換更慢，這是因為腦脊液中的成分要進入腦組織間隙需要通過緊密連接，相比之下交換較為困難[5]。

基于上述研究，本課題組提出腦細胞間液藥理學的研究思路。實驗動物口服或靜脈給藥后，采用含有藥物成分的腦細胞間液，研究對細胞或組織等模型的藥效和作用機制，即腦細胞間液藥理學。腦細胞間液是神經細胞生存的直接外環境，也是藥物成分透過血腦屏障作用于神經細胞的必經途徑，故腦細胞間液是檢測透過血腦屏障藥物成分的最佳載體。參照血清藥理學，檢測腦細胞間液中藥物成分，并以其作為干預因素進行體外實驗是腦細胞間液藥理學的主要內涵。

二、建立腦細胞間液藥理學的關鍵技術

微透析（Microdialysis）是灌流采樣與透析相結合的新型生物采樣技術，誕生于20世紀70年代，最早用來測定腦內神經遞質的含量。因微透析具有活體微創、可動態觀察、采樣量小的特點，在生命科學研究中應用越來越廣泛。尤其在能透過血腦屏障藥物的藥代動力學、生物利用度等研究中，微透析技術成為不可或缺的手段之一[7]。微透析技術用于腦細胞間液藥理學的優點如下：①微透析可以用于實驗動物的活體采樣，且對動物的傷害較小，屬于微創手術。在采樣過程中可以保持小型動物（大鼠、小鼠）清醒活動狀態，收集的數據能較為真實地反映動物的活體生物指標，不受大面積創傷、麻醉等激烈刺激的影響；②微透析樣品可以實時反映透析液中待測物的變化情況，以濃度為縱坐標，時間為橫坐標描繪待測物的量-時曲線，可以直觀地反映待測物含量的變化趨勢。若是微量樣品以微柱測定，時間間隔甚至可以縮短到3min，避免待測物因降解所造成的測定不準確；③樣品中無大分子物質，基本不需處理可直接分析。由于微透析樣品經對大分子無通透性的半透膜透析得來，蛋白質等大分子都被截留膜外（可透過分子量約為5000~50000Da），樣品可以直接由液相色譜、質譜等精密儀器分析，省時高效，避免樣品處理過程中損耗、引入其它雜質所造成的數據偏差；④腦微透析液可直接反映腦細胞間液中的藥物水平，在透析取樣過程中，由于與蛋白結合的藥物不能穿過半透膜，所以微透析樣品中所得的游離型藥物濃度更能體現與藥理作用的相關性；⑤微透析液是與神經細胞外環境組成高度相似的基質，從藥物或內源性成分的組成都適用于神經細胞的體外實驗。因此，微透析技術為腦細胞間液藥理學提供了技術保障。

三、腦細胞間液藥理學用于中藥復方研究的優勢

1.有助于中藥復方有效成分的靶向性篩選

中藥復方是中醫臨床用藥的主要形式，體現了中醫藥的特色與優勢，同時，中藥復方的研究也充滿了復雜性，其作用規律及作用機制研究引起世界學者的興趣[8]。本課題組認為，對中藥復方有效成分的研究必須與其特定功效緊密結合，具體問題具體分析[9]。我國學者王喜軍等進行了大量的血清藥物化學的實踐研究工作，他從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統療效的相關性。中藥歸經學說認為，藥物的功效與其歸經密切相關。受上述啟發，我們認為復方的有效成分也應與其代謝分布密切相關。靶向性篩選有助于研究中藥復方有效成分，即通過研究靶器官的藥物蓄積、代謝情況，為闡述藥物有效成分提供依據。針對腦血管疾病治療過程中的血腦屏障難題，藥物透過血腦屏障的靶向性研究是篩選腦保護中藥的重要途徑。雖然有研究表明中藥可通過作用于內皮細胞間接干預腦實質的病理變化[10]，但通過血腦屏障，直接作用于腦實質是腦保護藥物的主要作用途徑[11，12]。對治療腦部疾病的中藥化學組分進行靶向性篩選，檢測通過血腦屏障進入腦實質中的藥物組分，有助于發現中藥的腦保護物質基礎。如本課題組研究了由3味中藥組成的復方塞絡通膠囊（原：維腦康），給藥后大鼠腦微透析液中的藥物成分來源于其中兩味中藥的3種成分。

2.有利于動態觀察腦內藥理指標的變化

腦缺血等疾病發生后，腦細胞間液中興奮性氨基酸、單胺類神經遞質和乙酰膽堿等內源性物質含量發生變化，反映了疾病進程和病變機制。對腦細胞間液中上述內源性生物活性物質的檢測，是研究腦病發病機制和治療藥物的重要手段。如通過采用微透析技術研究腦細胞間液中興奮性氨基酸的含量，發現興奮性氨基酸異常釋放是腦缺血后的關鍵病理環節[13]，且一些治療藥物對此有抑制作用[14，15]。

另外，兒茶酚胺類神經遞質（DA和NE）、5-HT及乙酰膽堿的釋放增加與很多腦病發病機制相關[16，17]。基于微透析技術，檢測上述神經遞質在腦細胞間液中的含量變化可以動態、連續的反映其病理變化。

3.有利于體外研究中藥復方的作用機制

因腦細胞間液是神經細胞的真實生存環境，采用微透析技術采集的樣品是腦細胞間液的稀釋液，故微透析液體外培養神經細胞理論上存在可能。本課題組對MCAO大鼠給予復方中藥治療，收集腦微透析液進行體外藥理實驗。前期研究表明，采用含40%正常腦細胞間液的培養液，對正常和受損神經元的生存率和LDH釋放率均無顯著干預作用，而加入同樣濃度的含藥腦細胞間液，對受損神經元有顯著保護作用[18]。采用含藥微透析液，相比直接采用藥物或藥物有效成分進行體外細胞實驗，具有如下優點：①中藥復方制劑多為湯劑、膠囊、丸劑等，在加入培養液前的溶解、過濾等環節均存在較大困難，而微透析液中多為小分子物質，僅過濾除菌即可應用，其成分不會發生改變；②微透析液中的藥物成分是復方經吸收、代謝、透過血腦屏障后到達作用部位的實際狀態，更接近藥物在臨床中的應用；③中藥復方有可能作用于神經元外的其它細胞而發揮作用，如促進星型膠質細胞分泌神經營養因子，而腦細胞間液體現了給藥后腦內的內源性分子改變，所以可更全面體現復方的腦保護功效。

4.反映病理狀態下血腦屏障透過率的改變

在血清藥理學研究中，人們注意到中藥復方進入生理狀態下的動物機體與進入病理狀態的動物機體，其體內過程是不一致的[19]。在病理狀態下，藥物通過血腦屏障的透過率也不同于生理狀態。腦缺血引起炎癥反應、蛋白酶激活、氧自由基產生等一系列的病理變化，會導致緊密連接的破壞和血腦屏障通透性的增加，有些藥物較生理狀態時更容易進入血腦屏障[2]，如銀杏內酯B在缺血側半腦的藥物濃度顯著高于健側[20]。但有些藥物與之相反，如Spudich等[21]發現在局灶性腦缺血發生后，腦毛細血管內皮細胞的抗藥轉運體Mdr-1表達明顯上調，造成某些藥物透過血腦屏障明顯受阻。所以，腦缺血中風治療藥物的靶向性研究應在其相應病理模型上進行。另外，給藥劑量也應按臨床正常用量進行人與動物給藥劑量換算，既與臨床用藥規范相符合，又不會改變藥物代謝及與機體間的相互作用[1]。

四、腦細胞間液藥理學尚須解決的問題

病理狀態下血腦屏障通透性發生改變，腦細胞間液中藥物含量與生理狀態下有所不同，更接近臨床實際。從篩選藥物靶向性物質基礎的角度，應采集病理模型動物的微透析液進行分析。但因病理狀態下，微透析液中內源性毒性物質含量也同時增加，如微透析液中興奮性氨基酸含量會增加至正常水平的數十甚至數百倍，對神經細胞具有毒性作用。故病理狀態下微透析液不能直接用于體外神經細胞培養。尋求一種既能體現臨床實踐中透過血腦屏障的藥物成分含量，又能除去毒性因子的干擾的方法是使腦細胞間液藥理學進一步發展的途徑。本課題組已經對腦細胞間液藥理學進行了初步實踐，但其具體方法還有待進一步完善。

總之，腦細胞間液藥理學的提出為腦保護中藥復方的研究提供了一種新方法和思路，尤其在復方中藥有效物質篩選和體外機制研究方面存在較大優勢，具有明顯的創新意義。目前應用該模式研究中藥復方塞絡通膠囊取得了初步的結果，但做為一個新型的方法還存在一些不足，有待進一步研究。