聚氨基酸載體研究進(jìn)展范文

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現(xiàn)代藥物傳遞系統(tǒng)的研究離不開新型材料的使用,特別是藥用高分子材料,殼聚糖、透明質(zhì)酸、明膠、淀粉、海藻酸鈉、白蛋白、纖維素、聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸類、聚酯、聚醚類等已在藥劑學(xué)中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。但生物相容性、生物降解性和安全性制約了部分藥用高分子材料的使用,開發(fā)安全的且具有新型功能的高分子材料一直是藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位,是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。選用一種或多種氨基酸合成聚合物能在體內(nèi)酶的作用下降解為氨基酸,生物相容性好,且安全無毒,聚氨基酸的研究已受到廣泛的關(guān)注。采用天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸等制備聚氨基酸是一類低毒、生物相容性好、容易被機(jī)體吸收、代謝的生物降解高分子,在醫(yī)藥領(lǐng)域如藥物控釋、人造皮膚等方面具有廣泛的應(yīng)用。目前聚氨基酸作為藥物載體的研究主要集中在聚氨基酸-藥物偶聯(lián)物、聚氨基酸復(fù)合載體、氨基酸共聚物幾個(gè)方面:聚氨基酸與藥物通過化學(xué)鍵形成偶聯(lián)物,在體內(nèi)酸性環(huán)境及酶的作用下化學(xué)鍵斷裂釋放藥物,達(dá)到緩釋、靶向的作用,并且可以降低藥物的毒性;聚氨基酸與其他高分子材料形成復(fù)合載體以克服單一材料的不足以及實(shí)現(xiàn)新的功能;氨基酸共聚物亦可形成兩親性材料作為藥物載體,以提高藥物溶解性能,延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和實(shí)現(xiàn)靶向目的。

1聚氨基酸-藥物偶聯(lián)物

聚氨基酸含有活性氨基和羧基端,可以通過共價(jià)鍵與藥物結(jié)合,形成偶聯(lián)物,該偶聯(lián)物在體內(nèi)特定酸性環(huán)境及酶的作用下化學(xué)鍵斷裂釋放藥物,達(dá)到緩釋、靶向的作用,同時(shí)由于聚氨基酸的保護(hù)作用,能夠提高藥物的穩(wěn)定性,降低藥物的毒性。聚氨基酸-藥物偶聯(lián)物研究起始于上世紀(jì)70年代初,美國猶他大學(xué)Kim領(lǐng)導(dǎo)的課題組曾成功地合成了聚谷氨酸材料,用氨基丙醇為側(cè)鏈基,以共價(jià)結(jié)合方式與甾體避孕藥炔諾酮形成偶聯(lián)物,并進(jìn)行了體外及大鼠體內(nèi)釋放試驗(yàn),其釋藥時(shí)間達(dá)300余天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聚谷氨酸可降解為單體并不在生物體內(nèi)滯留。聚氨基酸含有活性羧基與藥物通過酯鍵結(jié)合是較為常見。另外聚氨基酸還可以通過腙鍵與藥物相連,因?yàn)殡赕I在低pH環(huán)境下時(shí)容易斷裂,在腫瘤低pH環(huán)境下靶向釋放。聚氨基酸與順鉑通過配位鍵結(jié)合或與生物藥物結(jié)合可延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。但由于該類載體是通過藥物與聚氨基酸共價(jià)鍵偶聯(lián),針對每一藥物都需要設(shè)計(jì)合適的反應(yīng)條件,并完成聚氨基酸-藥物偶聯(lián)物的制備,增加了實(shí)施的難度、提高了成本,因此在應(yīng)用上受到限制。

1·1通過酯鍵結(jié)合

陳汐敏等[1]制備了新型天冬氨酸-谷氨酸共聚物-甲硝唑納米粒,粒徑為198·9nm,載藥量達(dá)12%,1h與24h體外累積釋放百分率分別為12·19%和47·51%。戚曉紅等[2]制備了聚天冬氨酸-甲硝唑納米粒,平均粒徑為404·8nm,載藥量高達(dá)30%,24h體外累積釋放百分率為38·01%,并能持續(xù)釋放達(dá)30d,研究結(jié)果表明,聚天冬氨酸-甲硝唑納米粒顯著提高甲硝唑?qū)Φ蜗x的抑殺作用。因此,聚天冬氨酸是一種非常有潛力的載體。

1·2通過腙鍵結(jié)合

研究表明腫瘤組織pH低于正常組織,而腫瘤細(xì)胞內(nèi)更是偏酸性,內(nèi)含體和溶酶體pH低至5·0,利用pH的不同設(shè)計(jì)pH敏感給藥系統(tǒng)可以達(dá)到靶向的目的。Ponta等[3]將PEG-Pasp[poly(ethyleneglycol)-poly(asparticacid)]共聚物的天冬氨酸羧基與氨基乙酸甲酯或4-氨基苯甲酸甲酯的氨基反應(yīng)再與肼反應(yīng)后與阿霉素分子的羰基通過腙鍵共價(jià)鍵鏈接(腙鍵在弱酸環(huán)境易于解離),研究表明,不同相對分子質(zhì)量比的氨基乙酸甲酯鏈接的聚合物PEG-Pasp在pH5·0條件下藥物釋放均明顯快于pH7·4,如PEG與Pasp相對分子質(zhì)量比為12∶5,PEG相對分子質(zhì)量為12kD時(shí),測定48h,pH7·4時(shí)藥物釋放30%,pH5·0釋放40%。因此,該釋藥體系可使Dox在低pH條件下快速釋放而聚集于腫瘤部位。

1·3通過配位鍵結(jié)合

聚氨基酸與含金屬元素藥物之間通過配位鍵結(jié)合,在體內(nèi)緩慢釋放,延長其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。如NC-6004[4]為PEG-聚谷氨酸共聚物與順鉑的配位化合物,聚谷氨酸側(cè)鏈羧基通過配位反應(yīng)取代順鉑中氯原子后與鉑原子結(jié)合,順鉑從NC-6004中24h和96h分別釋放19·6%和47·8%,體內(nèi)維持較長時(shí)間血藥濃度,體內(nèi)AUC0-t和cmax分別是順鉑的65倍和8倍。

1·4基因融合

簡單的多肽鏈可以形成與PEG類似的空間伸展構(gòu)像,將蛋白與多肽鏈融合,可以起到穩(wěn)定蛋白的作用。多肽不僅比PEG能夠提供更均勻同源終端產(chǎn)物、避免生產(chǎn)過程中PEG的化學(xué)鏈接,而且多肽的長度可以根據(jù)調(diào)整半衰期的需要精確調(diào)控。Schellenberger等[5]采用丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸制備多肽36氨基酸片斷組成氨基酸隨機(jī)序列文庫,最終根據(jù)遺傳學(xué)穩(wěn)定性、溶解性、熱穩(wěn)定性、抗聚集性、以及雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白、DNA、脂多糖)的多少,篩選出一種由864個(gè)氨基酸組成的多肽,將該多肽融合到新型降糖藥Exenatide上,使其體內(nèi)半衰期由原來的2·4h延長至139h。

2聚氨基酸復(fù)合載體

聚氨基酸與常用高分子材料通過化學(xué)鍵或物理作用結(jié)合形成復(fù)合載體,可以實(shí)現(xiàn)緩釋、靶向、降低毒性、提高基因藥物的轉(zhuǎn)染率的目的。PEG與疏水性聚氨基酸形成兩親性聚合物,在溶液中可自動聚集成膠束,作為藥物載體;聚賴氨酸帶正電荷,與帶負(fù)電荷的基因藥物形成復(fù)合物,可提高載藥量和轉(zhuǎn)染效率,接上相應(yīng)配體可以實(shí)現(xiàn)靶向目的;亦可選擇合適聚氨基酸與陽離子材料殼聚糖通過電荷作用形成復(fù)合載體。聚氨基酸為兩性離子,在不同pH條件下結(jié)構(gòu)不同,親水性能也不同,可與聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成pH敏感復(fù)合載體。另外,親水性氨基酸有類似PEG的性能,用以修飾其他材料后形成復(fù)合載體以達(dá)到長循環(huán)作用。該類載體在應(yīng)用時(shí)存在如下幾個(gè)方面問題:1)合成復(fù)合載體增加成本,如PEG與氨基酸組成復(fù)合載體,首先要將PEG的端基活化為氨基、羧基等活性基團(tuán),增加了生產(chǎn)工序;2)復(fù)合載體增大安全性風(fēng)險(xiǎn):高分子材料如聚乙二醇、殼聚糖、聚乳酸等存在一定的免疫原性,聯(lián)合聚氨酸后可能增強(qiáng)免疫原型;3)復(fù)合載體的載藥性和降解性有待研究。因而這類載體目前尚未見產(chǎn)品面世。

2·1聚氨基酸與PEG組成復(fù)合載體

聚乙二醇(PEG)具有柔韌的親水性長鏈結(jié)構(gòu),又可生物降解,利用PEG親水性強(qiáng),分子鏈柔性,能夠包裹在聚合物膠束、脂質(zhì)體或納米粒等表面,從而使微粒給藥制劑避開單核吞噬細(xì)胞的吞噬,達(dá)到長循環(huán)作用。利用聚氨基酸所帶電荷不同、聚氨基酸的殘基親水性不同與PEG偶聯(lián)后以達(dá)到提高載藥量、緩釋、降低毒性或制備成pH敏感型載體。

Prompruk等[6]以PEG為親水段,天冬氨酸與苯丙氨酸(Phenylalanine)合成的聚合物作為疏水段,形成嵌段共聚物。天冬氨酸可以通過離子作用包載藥物,而苯丙氨酸的疏水性或者芳環(huán)相互作用有利于膠束形成,減緩膠束解離,延緩藥物的釋放。制備的PEG-P(asp-phe)(相對分子質(zhì)量比5∶6∶4)包載親水性藥物三氮脒,4h內(nèi)釋放35%,并可維持12h緩釋。

Wang等[7]合成mPEG與聚N-氨基酸基-DL-天冬酰胺接枝共聚物制備納米膠束,用于包載藥物順鉑,結(jié)果可維持40h緩慢釋放,并且可降低對Bel-7402細(xì)胞的毒性。選用帶正電荷的賴氨酸(lysine)包載基因藥物,以提高包封率和轉(zhuǎn)染效率等是聚氨基酸應(yīng)用研究熱點(diǎn)之一。Park等[8]研究PEG接枝或共聚L-賴氨酸(polyL-lysine,PLL)后通過物理吸附包裹在腺病毒表面,由于血清蛋白表現(xiàn)負(fù)電性,可通過離子交換作用使PLL-g-PEG去PEG化,而藥物釋放腺病毒,再通過CAR中介的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,結(jié)果包裹的腺病毒相對表達(dá)水平最高達(dá)370%。因此,可以通過簡單的物理包裹病毒,以提高轉(zhuǎn)染率,減少先天免疫反應(yīng)。

Choi等[9]制備PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)載質(zhì)粒DNA復(fù)合物,轉(zhuǎn)染效率是聚賴氨酸的80倍,細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)細(xì)胞存活率達(dá)95%,而使用聚賴氨酸或者聚乙烯亞胺的細(xì)胞存活率分別為65%和55%。

采用聚氨基酸與PEG共聚作為抗腫瘤藥物載體有NK012[10]已進(jìn)行Ⅰ期臨床研究,NK105已進(jìn)行Ⅱ期臨床研究[11]。NK105為PEG-聚天冬氨酸共聚物,通過疏水作用物理包裹紫杉醇,注射后血漿藥物濃度可以維持72h,而單用紫杉醇24h后就已經(jīng)檢測不出;用藥后5min血藥濃度及AUC分別是紫杉醇的11~20倍和50~86倍;臨床應(yīng)用膠束(相當(dāng)于紫杉醇25mg/kg)抗腫瘤活性與100mg/kg紫杉醇療效相當(dāng)。NK012為PEG-聚谷氨酸共聚物包載7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxy-CPT,SN-38),單用SN-38注射后濃度呈對數(shù)式速度下降,而HT-29腫瘤中使用NK102SN-38的清除率顯著降低,SN-38濃度維持在30ng/g長達(dá)168h,并且NK102在小鼠體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)表現(xiàn)高度聚集。

2·2與相應(yīng)配體結(jié)合

聚氨基酸-PEG與相應(yīng)配體結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)靶向的目的。Kim等[12]制備聚賴氨酸-PEG兩親性嵌段共聚物,并以葉酸(folicacid,FOL)修飾PEG,形成帶正電PLL-PEG-FOL聚合物,帶負(fù)電熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白(FITC-BSA)與PLL-PEG-FOL形成聚電解質(zhì)復(fù)合物,應(yīng)用于葉酸受體過表達(dá)KB細(xì)胞,該體系FITC-BSA表現(xiàn)出高攝取,結(jié)果證實(shí)提高攝取是由葉酸受體產(chǎn)生的。試驗(yàn)者采用葉酸受體缺乏細(xì)胞A549研究表明,PLL-PEG-FOL/FITC-BSA攝取量并未增加,因此證實(shí)該給藥體系可以通過葉酸受體達(dá)到靶向的目的。

Liu等[13]采用樹狀接枝聚賴氨酸-PEG-30肽(DGL-PEG-Leptin30,Leptin是內(nèi)源激素衍生物,作為腦靶向配體)與血漿DNA制備納米粒,運(yùn)載基因藥物穿過血-腦脊液屏障達(dá)到腦靶向作用。研究表明,DGL-PEG-Leptin30在體外實(shí)驗(yàn)中能夠穿越血-腦脊液屏障模型,而靜脈注射后可以在小鼠的腦內(nèi)聚集。總之,DGL-PEG-leptin30/DNA是相當(dāng)安全有效的腦靶向基因傳遞系統(tǒng)。

2·3與殼聚糖形成復(fù)合載體

殼聚糖是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的陽離子聚多糖,而氨基酸表現(xiàn)為兩性離子,在生理?xiàng)l件下,不同氨基酸可表現(xiàn)為陽離子型或陰離子型,選擇合適氨基酸能與殼聚糖通過靜電作用形成分子間聚合物。Shu等[14]制備水溶性殼聚糖(water-solublechitosan,WSC)聚天冬氨酸-PEG復(fù)合物(WSC/Pasp-PEG),包載牛血清白蛋白,載藥量最大可達(dá)40%左右,包封率最大90%左右。模擬體內(nèi)環(huán)境pH1·2、2·5和7·4條件下體外藥物釋放研究,釋放速度pH7·4>pH1·2>pH2·5,這是因?yàn)閜H1·2時(shí)Pasp的羧基以-COOH形式存在,WSC與Pasp之間的靜電作用力減弱,復(fù)合物不穩(wěn)定,破裂后藥物釋放。在pH7·4時(shí)WSC的去離子化,導(dǎo)致納米粒崩塌,藥物快速釋放;空腹胃內(nèi)pH(pH2·5)時(shí),藥物緩慢釋放。因此,建議餐前服用。

2·4與聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成復(fù)合載體

聚乳酸-羥基乙酸共聚物也是藥劑學(xué)中常用高分子材料,常作制備微球的材料。Yang等[15]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚谷氨酸共聚(PLGA-b-PGA),制備成pH敏感聚合物,在pH3~9范圍內(nèi),隨著pH升高,該聚合物依次呈紊亂形態(tài)(pH3)、膠束(pH5)、伴有厚壁的半囊泡(pH7)、囊泡(pH9),因此,可以通過環(huán)境pH改變控制藥物釋放。

2·5與聚乙酰亞胺形成復(fù)合載體

聚乙烯亞胺富含氨基,可與DNA鏈上負(fù)電性的磷酸根通過靜電作用締合成復(fù)合物,在此過程中,DNA會被高度壓縮成50~200nm大小的納米球,大大增強(qiáng)了對細(xì)胞膜的穿透作用,因此具有較高的轉(zhuǎn)染效率,是目前研究較多的聚陽離子型基因載體。陳丹等[16]以天冬氨酸、谷氨酸為單體,經(jīng)過聚合后作為母體骨架,將低分子聚乙酰亞胺偶合于母體上,作為DNA藥物的載體,轉(zhuǎn)染效率是聚乙酰亞胺的兩倍,并且體外細(xì)胞毒性并沒有增加。

2·6聚氨基酸作為親水修飾材料應(yīng)用

雖然PEG通常被用來作為親水性修飾材料,但PEG修飾的過程增加了制劑的成本和產(chǎn)生了雜質(zhì)[17-18],PEG修飾后在動物模型反復(fù)用藥后表現(xiàn)出腎小管空泡,而且PEG的空間位阻限制了載體的細(xì)胞攝取。另外,應(yīng)用PEG后在動物和人體也會產(chǎn)生抗體[19]。因此,研究人員嘗試采用親水性氨基酸來代替PEG。

Romberg等[20]分別用摩爾分?jǐn)?shù)為5%的聚羥乙基L-天冬酰胺[poly(hydroxyethylL-asparagine,PHEA,相對分子質(zhì)量3kD]、聚羥乙基L-谷氨酰胺[poly(hydroxyethylL-gluta-mine),PHEG,相對分子質(zhì)量4kD]修飾脂質(zhì)體,并比較其半衰期,未包裹脂質(zhì)體半衰期9·7h,用聚天冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂質(zhì)體半衰期分別為14·4h和11·9h。組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E都能使PHEA和PHEG降解,并且修飾后脂質(zhì)體體外激活補(bǔ)體能力大大降低,PHEA修飾的脂質(zhì)體激活程度小于PHEG修飾的脂質(zhì)體。

Romberg等[21]隨后驗(yàn)證了聚(羥乙基L-谷氨酰胺)-N-琥珀雙十八烷基胺包裹脂質(zhì)體,能夠?qū)σ远退崃字瑸橹饕M成的脂質(zhì)體起穩(wěn)定作用,并且由于脂質(zhì)體外層包裹的聚氨基酸脫落可以控制藥物釋放。

Schlapschy等[22]證明通過聚氨基酸修飾HER-2抗體Fab段4D5,可以顯著延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。4D5半衰期僅為0·5h左右,而采用甘氨酸豐富的均聚氨基酸(Gly4Ser)n100或200個(gè)重復(fù)單元修飾4D5后,其半衰期分別為2·1h和5·7h。

以上研究表明,采用親水性氨基酸同樣可以達(dá)到長循環(huán)作用,從而避免了PEG的不良反應(yīng)。

3氨基酸共聚物

采用一種或幾種氨基酸合成聚合物作為藥物載體,其代謝產(chǎn)物對人體無毒,比其他高分子材料具有更高的安全性,氨基酸來源豐富,價(jià)格便宜,組成人體氨基酸有20種,可以根據(jù)需要選擇,滿足不同藥物載體的需要,聚氨基酸分子鏈上具有很多活性基團(tuán)(如:氨基、羧基),藥物或活性物質(zhì)能方便與之結(jié)合,因此聚氨基酸作為藥物載體也越來越受到關(guān)注。聚氨基酸作為藥物載體在應(yīng)用時(shí)應(yīng)該注意:

1)聚氨基酸在體內(nèi)降解為氨基酸,要注意克服由此帶來的不良反應(yīng),如患有苯丙酮尿癥病人不宜使用含苯丙氨酸的載體;2)氨基酸在一定條件下帶有電荷,選用帶不同電荷的氨基酸制備藥物載體要防止由于電荷吸引而導(dǎo)致的載體的聚集;3)氨基酸形成聚合物聚合度高時(shí)會出現(xiàn)溶解性問題。

韓亞冬等[23]以聚L-谷氨酸為載體材料,采用無水乳液法制備口服胰島素微球,微球直徑在5~20μm,載藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~9%。載藥微球具有良好的pH敏感釋放行為,在胃模擬液中2h釋放量約為5%,在腸道模擬液中2h釋放90%以上,因此,可以使胰島素靶向于腸道釋放,避免胃酸對胰島素的破壞。

Akagi等[24]以相對分子質(zhì)量為300kD的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)與L-苯丙氨酸乙酯接枝共聚,并采用水溶性碳二亞胺將卵清蛋白固化至γ-PGA納米粒上或?qū)⒙亚宓鞍装苽浼{米粒。L-苯丙氨酸乙酯與卵清蛋白疏水區(qū)域之間通過疏水作用,該載體37℃,pH7·4條件下10d的釋放量不超過5%。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,該納米粒對HL-60細(xì)胞無任何毒性,具有生物降解性和生物相容性,能調(diào)節(jié)分布和細(xì)胞特異性傳遞,有望作為蛋白類藥物載體。Kima等[25]以L-谷氨酸γ-芐酯與L-苯丙氨酸合成嵌段供聚物,經(jīng)脫去芐酯后形成兩親性共聚物制備泡囊,有望作為藥物載體。

Du等[26]證實(shí)同服聚天冬氨酸可以提高細(xì)胞內(nèi)氨基糖苷類藥物濃度并且降低毒性。在給予慶大霉素的同時(shí)給予聚天冬氨酸,細(xì)胞內(nèi)慶大霉素濃度是單獨(dú)使用慶大霉素的1·2~1·3倍。

4結(jié)語

聚氨基酸生物相容性好、容易被機(jī)體吸收、體內(nèi)降解為氨基酸對人體無毒副作用,最為突出的是具有很多藥物或活性物質(zhì)能與之共價(jià)鍵結(jié)合的功能團(tuán),聚氨基酸的研究已相當(dāng)深入和廣泛。目前合成聚氨基酸多是采用氨基酸與三光氣作用形成氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐,采用伯氨基引發(fā)開環(huán)形成新的伯氨基酸再引發(fā)其他氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐的開環(huán),如此循環(huán),形成聚合物,但要工業(yè)化合成均一、質(zhì)量穩(wěn)定的聚氨基酸尚待研究。2008年日本窒素公司和福井縣立大學(xué)宣布發(fā)現(xiàn)了均聚氨基酸合成酶[27],這一發(fā)現(xiàn)給生物合成聚氨基酸提供了基礎(chǔ)。聚氨基酸在給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用已成為藥劑學(xué)研究熱點(diǎn),并且正在進(jìn)行臨床試驗(yàn),相信很快能得到廣泛應(yīng)用。