mGluR6對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)的影響范文

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摘要目的：探討代謝型谷氨酸受體6（mglur6）對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法：利用MTT比色法分析mGluR6過表達(dá)載體、mGluR6siRNA在不同時(shí)間對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響，神經(jīng)球測量方法分析mGluR6對(duì)大鼠神經(jīng)球增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6對(duì)大鼠NSCs細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果表明，在處理24h，48h和72h后，過表達(dá)mGluR6顯著增強(qiáng)大鼠NSCs的細(xì)胞活力，促進(jìn)NSCs增殖，神經(jīng)球直徑顯著增大；mGluR6siRNA抑制大鼠NSCs的增殖。過表達(dá)mGluR6后，與對(duì)照組相比G1／G0期和細(xì)胞比率顯著下降，S期細(xì)胞比率顯著上升，促進(jìn)了細(xì)胞G1到S期轉(zhuǎn)換；沉默mGluR6后，G1／G0期和細(xì)胞比率顯著增加，S期細(xì)胞比率顯著下降，抑制了大鼠NSCs細(xì)胞G1到S期轉(zhuǎn)換。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)顯示，過表達(dá)mGluR648h后，大鼠NSCs細(xì)胞早凋和晚凋均顯著下降；沉默mGluR6顯著誘導(dǎo)大鼠NSCs的早凋和晚凋。結(jié)論：mGluR6可促進(jìn)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，抑制NSCs凋亡。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞；代謝型谷氨酸受體6；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；胚胎；大鼠

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是危害人類健康重大疾病之一，神經(jīng)損傷后的治療和康復(fù)是醫(yī)學(xué)界的重要問題［1－2］。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，改變了以往認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不能再生的觀念，這促使干細(xì)胞成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療新策略而備受關(guān)注。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，在特定的條件下可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。許多因素例如神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、化學(xué)引誘物等參與調(diào)控NSCs的分化與增殖。谷氨酸是NSCs中最關(guān)鍵的性神經(jīng)遞質(zhì)，它通過與相應(yīng)的受體分子作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能［3］。根據(jù)藥理學(xué)和電生理學(xué)的特征，谷氨酸受體分為兩種：即代謝型受體（Metabotropicgluta－matereceptors，mGluRs）和離子型受體（Ionotropicglitamatereceptors，iGluRs）。iGluRs按其特異靶向激動(dòng)劑的不同，又分為α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－異惡唑丙酸（AMPA）、N－甲基－D－門冬氨酸（NMDA）及紅藻氨酸（KA）三類受體；mGluRs屬于G－蛋白偶聯(lián)受體家族，按其氨基酸序列、激動(dòng)劑選擇性和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的差異分為三組，分別為組I（mGluR1，mGluR5）、組II（mGluR2－3）和組III（mGluR4，mGluR6－8［4］。作為G蛋白耦聯(lián)受體家族，mGluRs的生物學(xué)功能主要通過激活胞內(nèi)第二信使通路從而引起生物學(xué)效應(yīng)［5］。自1993年研究者將mGluR6從大鼠視網(wǎng)膜的cDNA文庫中分離出來［6］，Masu等人發(fā)現(xiàn)mGluR6主要存在于視網(wǎng)膜細(xì)胞中，并在視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的突觸傳遞中發(fā)揮重要作用［7］。Foreman等人通過West－ernblot方法在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達(dá)，這也是研究人員首次在除視網(wǎng)膜外的其它細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達(dá)，他們的研究結(jié)果表明mGluR6通過抑制Ca2＋內(nèi)流，抑制一氧化氮（NO）的產(chǎn)生［8］。隨后，人們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達(dá)［9］。值得一提的是，Vardi等人通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在mGluR6啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建GFP報(bào)告基因，在角膜內(nèi)皮、睪丸、腎髓質(zhì)、腎小球、以及B淋巴細(xì)胞等非神經(jīng)組織細(xì)胞中檢測到mGluR6的表達(dá)［10］。該研究結(jié)果拓寬了人們對(duì)mGluR6調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的認(rèn)識(shí)，說明mGluR6并不局限于視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)揮作用，但其相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制至今未見報(bào)道。最近Zheng等在人緣表皮角化細(xì)胞系HaCaT中研究表明，敲除mGluR6導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mGluR6可能通過CaMKII／ERKMLC信號(hào)通路調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用［11］，截至目前，mGluR6是否參與NSCs生長及其調(diào)控機(jī)制還鮮見相關(guān)報(bào)道。在這個(gè)研究中，我們旨在探討mGluR6對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague－Dawley（SD）大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)嚴(yán)格遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令第55號(hào)的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》和國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)第2號(hào)令的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。孕鼠受孕后15d，對(duì)胚胎鼠進(jìn)行分離，然后對(duì)大鼠胚胎NPCs進(jìn)行培養(yǎng)。研究得到了延安大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的同意。2實(shí)驗(yàn)試劑DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基，N2、B27添加劑，bFGF購自Gibco公司（美國）；EGF、肝素、MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）購自Sigma公司（美國）；AnnexinⅤ－FITC凋亡試劑盒購自美BDBioscience公司（美國）；RIPA裂解液購于碧云天公司；兔抗mGluR6、鼠抗β－Actin均購自SantaCruzBiotechnology公司（美國）；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自Pierce公司（美國）。3大鼠胚胎皮質(zhì)NPCs的分離和培養(yǎng)胚胎分離自孕15d大鼠，動(dòng)物處理符合倫理要求和原則。從這些胚胎中分離腦組織并將其置于DMEM／F12中，去除所有腦膜后，分離大腦皮層，用DMEM／F12沖洗兩次；將分離的大腦皮層切成小塊，37℃胰酶消化5min，用吸管吹打分散使組織分散為單細(xì)胞。用200目篩網(wǎng)過濾后，將細(xì)胞懸液移到離心管中，800轉(zhuǎn)離心5min后，重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng／mlEGF，10ng／mlbFGF，1×B27supplement，1×N2supplement，100U／ml鏈霉素，100U／ml青霉素，0．4U／ml肝素）中，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105／ml后，以4ml／瓶接種于T50培養(yǎng)瓶中，37℃孵育，5～7d后傳代。（本研究所用的NSCs均為傳1代的細(xì)胞）。4載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)所需mGluR6siRNA序列由上海吉瑪公司合成，序列信息如下：鼠mGluR6siRNA：sense5’－CCCCAGUGAUGUUCAAUGATT－3’antisense5’－UCAUUGAACAUCA－CUGGGGTT－3’隱形對(duì)照siRNANC－siRNA：sense5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’antisense5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’過表達(dá)載體pCMV2－GV146－GFP－mGluR6由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，6孔板中NSCs細(xì)胞數(shù)量為（0．8～2．4）×105，生長1d后加入過表達(dá)質(zhì)粒DNA4μg或者干DNA片段4μl以及TurboFectTM6μl進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過qRT－PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。5RNA提取及qRT－PCR采用Omega試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測量RNA濃度。根據(jù)生物信息學(xué)設(shè)計(jì)合成mGluR6和β－actin的qRT－PCR引物，序列如下：mGluR6－F5’－GGACGCCAAGTAGCAAG－GTT－3’mGluR6－R5’－TCCGATGGTCTCTGTG－GATCT－3’β－Actin－F5’－GGAGATTACTGCCCTG－GCTCCTA－3’β－Actin－R5’－GACTCATCGTACTC－CTGCTTGCTG－3’，使用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及qRT－PCR，按照SYBRPremixExTaqTMⅡ進(jìn)行反應(yīng)，條件為：95℃，1min預(yù)變性，95℃變性10s，60℃退火，延伸40s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，采用2－ΔΔCt的方法計(jì)算mGluR6的表達(dá)量。6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6影響鼠NSCs的細(xì)胞周期按照2×104個(gè)／孔將傳1代的NSCs種入6孔板中，每孔單細(xì)胞懸液為2ml，培養(yǎng)48h后加藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA組，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)。24h后，處理各組單細(xì)胞懸液，PI染色，流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6對(duì)鼠NSCs細(xì)胞周期的影響。7MTT實(shí)驗(yàn)檢測mGluR7對(duì)人胚胎NSCs細(xì)胞活力的影響按照2×104個(gè)／孔將傳1代的NSCs種入96孔板中，每孔單細(xì)胞懸液為200μl，常規(guī)培養(yǎng)48h后，給予藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為三組：正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h后上機(jī)檢測鼠胚胎NSCs細(xì)胞增殖能力。8神經(jīng)球直徑測量神經(jīng)球直徑測量實(shí)驗(yàn)步驟如下：將傳1代的NSCs分散成單個(gè)細(xì)胞，按照20000個(gè)／孔種入96孔板中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)48h后給予藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA組。分別于轉(zhuǎn)染后24h，48h和72h后，通過Image－ProExpress（IPP）圖像分析軟件并取圖片，進(jìn)而研究mGluR6對(duì)各組神經(jīng)球直徑的影響。9通過流式細(xì)胞術(shù)分析mGluR6對(duì)鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞培養(yǎng)及分組同上，最后加入400μl的1×bindingbuffer，反復(fù)混勻重懸細(xì)胞，再加5μlAnnexinV－FITC，于4°C避光染色15min。最后加入10μlPI染液，避光4°C染色5min，采用流式細(xì)胞儀檢測，分析mGluR6對(duì)鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響。10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用單因素方差分析（One－WayANOVA）進(jìn)行差異分析，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1過表達(dá)或沉默mGluR6后其表達(dá)變化為了研究mGluR6對(duì)大鼠胚胎NSCs生長對(duì)影響，我們構(gòu)建了mGluR6的干擾RNA表達(dá)質(zhì)粒（mGluR6siR－NA）、過表達(dá)質(zhì)粒（mGluR6）及對(duì)照質(zhì)粒。我們對(duì)大鼠胚胎NSCs細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了干擾RNA（mGluR6siRNA）、過表達(dá)（mGluR6）和對(duì)照質(zhì)粒。通過qRT－PCR和WesternBlot檢測mGluR6的過表達(dá)及沉默效率，結(jié)果表明大鼠胚胎NSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后，在mRNA和蛋白水平mGluR6的表達(dá)量均顯著升高（圖1A，B）；轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA后，在mRNA和蛋白水平mGluR6的表達(dá)量均顯著降低（圖1A，B），證實(shí)了mGluR6的過表達(dá)載體和mGluR6siRNA是有效的，并將用于后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。2mGluR6對(duì)大鼠NSCs增殖的影響我們通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)或沉默mGluR6對(duì)大鼠NSCs增殖的影響。結(jié)果表明，大鼠胚胎NSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)mGluR6質(zhì)粒48h后，顯著促進(jìn)了細(xì)胞活力（圖2A）；轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA質(zhì)粒48h后，顯著抑制了細(xì)胞活力（圖2B）。為了進(jìn)一步檢測mGluR6對(duì)大鼠神經(jīng)球增殖的影響，我們測量了神經(jīng)球直徑，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒組的神經(jīng)球直徑明顯比對(duì)照組大（圖3A），而轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA質(zhì)粒組的神經(jīng)球明顯小于對(duì)照組（圖3B）。這表明mGluR6促進(jìn)了大鼠NSCs增殖。3mGluR6對(duì)大鼠NSCs細(xì)胞周期的影響為了研究mGluR6對(duì)大鼠NSCs細(xì)胞周期的影響，我們將mGluR6過表達(dá)和干擾siRNA分別轉(zhuǎn)染至大鼠NSCs細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染mGluR6過表達(dá)質(zhì)粒后，G1／G0期和細(xì)胞比率顯著下降，S期細(xì)胞比率顯著上升，促進(jìn)了細(xì)胞周期G1到S期轉(zhuǎn)換（圖4、5）；而轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA后，G1／G0期和細(xì)胞比率顯著增加，S期細(xì)胞比率顯著下降，抑制了細(xì)胞周期G1到S期轉(zhuǎn)換（圖6、7）。4mGluR6對(duì)大鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響為了研究mGluR6對(duì)大鼠NSCs細(xì)胞凋亡的影響，我們將mGluR6過表達(dá)質(zhì)粒和干擾siRNA分別轉(zhuǎn)染至大鼠NSCs細(xì)胞中。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染mGluR6過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞早凋和晚凋比率均顯著下降（圖8、9）；而轉(zhuǎn)染mGluR6siRNA的大鼠NSCs早凋和晚凋比率均顯著增加，特別是晚凋比率顯著增強(qiáng)（圖10、11）。

討論

在發(fā)育和成熟哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細(xì)胞（Neuralstemcells，NSCs）的研究為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的損傷、治療和修復(fù)帶來了希望。目前，NSCs已經(jīng)被廣泛用來治療Huntington病、缺血性中風(fēng)、脫髓鞘病及腦等CNS疾病，NSCs的治療手段已被廣大同行認(rèn)可，特別在改善神經(jīng)損傷、腦缺血以及神經(jīng)變性紊亂相關(guān)疾病后的神經(jīng)功能［12－16］。研究NSCs并應(yīng)用在CNS替代治療中，基因調(diào)控及蛋白質(zhì)功能改變對(duì)NPCs的增殖起著非常重要的作用。所以，探究NPCs增殖過程中的分子網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)及神經(jīng)退行性疾病的治療等方面具有重要價(jià)值.隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)谷氨酸可能通過mGluRs對(duì)腦損傷后的神經(jīng)發(fā)生有一定的調(diào)控作用［17－18］。本小組前期研究中發(fā)現(xiàn)，mGluR3［19］、mGluR5［20］和mGluR7［21］均與NSCs的生物學(xué)功能有著密切的關(guān)系。mGluR6是代謝性谷氨酸受體第III組的重要成員。自1993年被Nakajima等人報(bào)道m(xù)GluR6在大鼠視網(wǎng)膜中生物學(xué)功能以來［6］，許多研究表明mGluR6在視桿和視錐細(xì)胞的突觸傳遞過程中至關(guān)重要。最近，Devi等人發(fā)現(xiàn)mGluR6在人類黑色素細(xì)胞中表達(dá)，且能夠促進(jìn)黑色素的含量［22］。但是，mGluR6是否參與NSCs生長及其調(diào)控機(jī)制還不清楚，值得進(jìn)一步深入研究。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)了mGluR5促進(jìn)了人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖及其機(jī)制［20］。為研究mGluR6對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究選擇以大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）為研究材料，通過構(gòu)建mGluR6過表達(dá)和siRNA處理大鼠胚胎NSCs，分析其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，mGluR6過表達(dá)載體能增加體外培養(yǎng)的大鼠NSCs的細(xì)胞活力和神經(jīng)球的大小。相反，mGluR6siRNA降低了NSCs的細(xì)胞活力和神經(jīng)球的大小。這些研究結(jié)果表明，mGluR6可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠胚胎NSCs的增殖。細(xì)胞周期中G1向S期的過渡是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要節(jié)點(diǎn)，當(dāng)G1／S節(jié)點(diǎn)通過后，細(xì)胞周期依次進(jìn)行，然后逐漸回到G1期，這個(gè)階段不容易受到其他調(diào)節(jié)因素［23］的影響。M期表明細(xì)胞處于增殖和分裂階段，S期表明細(xì)胞開始新一輪的DNA復(fù)制和分裂。本研究發(fā)現(xiàn)，在mGluR6siRNA處理NSCs后，G1／G0期細(xì)胞比率升高，S期細(xì)胞比率下降，mGluR6siRNA將人NSCs細(xì)胞阻滯在G1／G0期，細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂顯著減少。但與之對(duì)應(yīng)的是，過表達(dá)mGluR6后，與對(duì)照組相比G1／G0期細(xì)胞比率顯著下降，S期細(xì)胞比率顯著上升，mGluR6過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞G1到S期轉(zhuǎn)化。綜上所述，mGluR6同其它mGluRs在促神經(jīng)發(fā)生方面主要可能通過以下功能來實(shí)現(xiàn)：①直接的促增殖作用；②促NSCs／神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化；③促存活、抗凋亡神經(jīng)保護(hù)作用。

作者：王玉玨 辛寧寧 單位：延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè) 咸陽師范學(xué)院校醫(yī)院