mGluR6對大鼠胚胎神經干細胞生物學的影響范文

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摘要目的：探討代謝型谷氨酸受體6（mglur6）對大鼠胚胎神經干細胞生物學功能的影響。方法：利用MTT比色法分析mGluR6過表達載體、mGluR6siRNA在不同時間對大鼠胚胎神經干細胞活力的影響，神經球測量方法分析mGluR6對大鼠神經球增殖的影響，流式細胞術分析mGluR6對大鼠NSCs細胞周期及凋亡的影響。結果：MTT結果表明，在處理24h，48h和72h后，過表達mGluR6顯著增強大鼠NSCs的細胞活力，促進NSCs增殖，神經球直徑顯著增大；mGluR6siRNA抑制大鼠NSCs的增殖。過表達mGluR6后，與對照組相比G1／G0期和細胞比率顯著下降，S期細胞比率顯著上升，促進了細胞G1到S期轉換；沉默mGluR6后，G1／G0期和細胞比率顯著增加，S期細胞比率顯著下降，抑制了大鼠NSCs細胞G1到S期轉換。應用流式細胞術顯示，過表達mGluR648h后，大鼠NSCs細胞早凋和晚凋均顯著下降；沉默mGluR6顯著誘導大鼠NSCs的早凋和晚凋。結論：mGluR6可促進大鼠胚胎神經干細胞的增殖，抑制NSCs凋亡。

關鍵詞：神經干細胞；代謝型谷氨酸受體6；細胞增殖；細胞凋亡；胚胎；大鼠

神經系統疾病是危害人類健康重大疾病之一，神經損傷后的治療和康復是醫學界的重要問題［1－2］。干細胞的發現，改變了以往認為成年哺乳動物中樞神經系統的神經細胞不能再生的觀念，這促使干細胞成為中樞神經系統疾病治療新策略而備受關注。神經干細胞（NSCs）是一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，在特定的條件下可以分化形成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。許多因素例如神經遞質、神經營養因子、化學引誘物等參與調控NSCs的分化與增殖。谷氨酸是NSCs中最關鍵的性神經遞質，它通過與相應的受體分子作用，參與中樞神經系統正常的生理功能［3］。根據藥理學和電生理學的特征，谷氨酸受體分為兩種：即代謝型受體（Metabotropicgluta－matereceptors，mGluRs）和離子型受體（Ionotropicglitamatereceptors，iGluRs）。iGluRs按其特異靶向激動劑的不同，又分為α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－異惡唑丙酸（AMPA）、N－甲基－D－門冬氨酸（NMDA）及紅藻氨酸（KA）三類受體；mGluRs屬于G－蛋白偶聯受體家族，按其氨基酸序列、激動劑選擇性和信號傳導機制的差異分為三組，分別為組I（mGluR1，mGluR5）、組II（mGluR2－3）和組III（mGluR4，mGluR6－8［4］。作為G蛋白耦聯受體家族，mGluRs的生物學功能主要通過激活胞內第二信使通路從而引起生物學效應［5］。自1993年研究者將mGluR6從大鼠視網膜的cDNA文庫中分離出來［6］，Masu等人發現mGluR6主要存在于視網膜細胞中，并在視網膜雙極細胞的突觸傳遞中發揮重要作用［7］。Foreman等人通過West－ernblot方法在大鼠骨髓基質細胞中檢測到mGluR6的表達，這也是研究人員首次在除視網膜外的其它細胞中檢測到mGluR6的表達，他們的研究結果表明mGluR6通過抑制Ca2＋內流，抑制一氧化氮（NO）的產生［8］。隨后，人們在前列腺癌細胞和小神經膠質細胞中檢測到mGluR6的表達［9］。值得一提的是，Vardi等人通過轉基因技術在mGluR6啟動子區域構建GFP報告基因，在角膜內皮、睪丸、腎髓質、腎小球、以及B淋巴細胞等非神經組織細胞中檢測到mGluR6的表達［10］。該研究結果拓寬了人們對mGluR6調控細胞發育的認識，說明mGluR6并不局限于視網膜細胞中發揮作用，但其相應的調控機制至今未見報道。最近Zheng等在人緣表皮角化細胞系HaCaT中研究表明，敲除mGluR6導致細胞骨架重組，進一步研究發現mGluR6可能通過CaMKII／ERKMLC信號通路調節角質細胞的吞噬作用［11］，截至目前，mGluR6是否參與NSCs生長及其調控機制還鮮見相關報道。在這個研究中，我們旨在探討mGluR6對大鼠胚胎神經干細胞生物學功能的影響。

材料和方法

1實驗動物Sprague－Dawley（SD）大鼠由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。本研究中使用的實驗動物的飼養嚴格遵循中華人民共和國衛生部令第55號的《醫學實驗動物管理實施細則》和國家科學技術委員會第2號令的《實驗動物管理條例》。孕鼠受孕后15d，對胚胎鼠進行分離，然后對大鼠胚胎NPCs進行培養。研究得到了延安大學醫學倫理委員會的同意。2實驗試劑DMEM／F12（1∶1）培養基，N2、B27添加劑，bFGF購自Gibco公司（美國）；EGF、肝素、MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）購自Sigma公司（美國）；AnnexinⅤ－FITC凋亡試劑盒購自美BDBioscience公司（美國）；RIPA裂解液購于碧云天公司；兔抗mGluR6、鼠抗β－Actin均購自SantaCruzBiotechnology公司（美國）；ECL化學發光底物試劑盒購自Pierce公司（美國）。3大鼠胚胎皮質NPCs的分離和培養胚胎分離自孕15d大鼠，動物處理符合倫理要求和原則。從這些胚胎中分離腦組織并將其置于DMEM／F12中，去除所有腦膜后，分離大腦皮層，用DMEM／F12沖洗兩次；將分離的大腦皮層切成小塊，37℃胰酶消化5min，用吸管吹打分散使組織分散為單細胞。用200目篩網過濾后，將細胞懸液移到離心管中，800轉離心5min后，重懸于完全培養基（DMEM／F12基礎培養基中加入20ng／mlEGF，10ng／mlbFGF，1×B27supplement，1×N2supplement，100U／ml鏈霉素，100U／ml青霉素，0．4U／ml肝素）中，將細胞密度調整至1×105／ml后，以4ml／瓶接種于T50培養瓶中，37℃孵育，5～7d后傳代。（本研究所用的NSCs均為傳1代的細胞）。4載體構建和細胞轉染本實驗所需mGluR6siRNA序列由上海吉瑪公司合成，序列信息如下：鼠mGluR6siRNA：sense5’－CCCCAGUGAUGUUCAAUGATT－3’antisense5’－UCAUUGAACAUCA－CUGGGGTT－3’隱形對照siRNANC－siRNA：sense5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’antisense5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’過表達載體pCMV2－GV146－GFP－mGluR6由上海生工生物工程有限公司構建。細胞轉染前，6孔板中NSCs細胞數量為（0．8～2．4）×105，生長1d后加入過表達質粒DNA4μg或者干DNA片段4μl以及TurboFectTM6μl進行轉染，并通過qRT－PCR方法檢測轉染效率。5RNA提取及qRT－PCR采用Omega試劑盒提取細胞總RNA，測量RNA濃度。根據生物信息學設計合成mGluR6和β－actin的qRT－PCR引物，序列如下：mGluR6－F5’－GGACGCCAAGTAGCAAG－GTT－3’mGluR6－R5’－TCCGATGGTCTCTGTG－GATCT－3’β－Actin－F5’－GGAGATTACTGCCCTG－GCTCCTA－3’β－Actin－R5’－GACTCATCGTACTC－CTGCTTGCTG－3’，使用TaKaRa公司逆轉錄試劑盒與熒光實時定量PCR試劑盒進行逆轉錄及qRT－PCR，按照SYBRPremixExTaqTMⅡ進行反應，條件為：95℃，1min預變性，95℃變性10s，60℃退火，延伸40s，重復40個循環，采用2－ΔΔCt的方法計算mGluR6的表達量。6應用流式細胞術分析mGluR6影響鼠NSCs的細胞周期按照2×104個／孔將傳1代的NSCs種入6孔板中，每孔單細胞懸液為2ml，培養48h后加藥物干預。實驗分組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組，加入藥物后繼續培養。24h后，處理各組單細胞懸液，PI染色，流式細胞術分析mGluR6對鼠NSCs細胞周期的影響。7MTT實驗檢測mGluR7對人胚胎NSCs細胞活力的影響按照2×104個／孔將傳1代的NSCs種入96孔板中，每孔單細胞懸液為200μl，常規培養48h后，給予藥物干預。實驗分為三組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組。每組設3個復孔，在轉染后24h、48h和72h后上機檢測鼠胚胎NSCs細胞增殖能力。8神經球直徑測量神經球直徑測量實驗步驟如下：將傳1代的NSCs分散成單個細胞，按照20000個／孔種入96孔板中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養48h后給予藥物干預。實驗分組：正常對照組、陰性對照組、siRNA組。分別于轉染后24h，48h和72h后，通過Image－ProExpress（IPP）圖像分析軟件并取圖片，進而研究mGluR6對各組神經球直徑的影響。9通過流式細胞術分析mGluR6對鼠NSCs細胞凋亡的影響細胞培養及分組同上，最后加入400μl的1×bindingbuffer，反復混勻重懸細胞，再加5μlAnnexinV－FITC，于4°C避光染色15min。最后加入10μlPI染液，避光4°C染色5min，采用流式細胞儀檢測，分析mGluR6對鼠NSCs細胞凋亡的影響。10統計學方法采用SPSS13．0統計學軟件進行數據分析，數據均以均數±標準誤表示，利用單因素方差分析（One－WayANOVA）進行差異分析，P＜0．05表示差異有統計學意義。

結果

1過表達或沉默mGluR6后其表達變化為了研究mGluR6對大鼠胚胎NSCs生長對影響，我們構建了mGluR6的干擾RNA表達質粒（mGluR6siR－NA）、過表達質粒（mGluR6）及對照質粒。我們對大鼠胚胎NSCs細胞分別轉染了干擾RNA（mGluR6siRNA）、過表達（mGluR6）和對照質粒。通過qRT－PCR和WesternBlot檢測mGluR6的過表達及沉默效率，結果表明大鼠胚胎NSCs細胞轉染過表達質粒后，在mRNA和蛋白水平mGluR6的表達量均顯著升高（圖1A，B）；轉染mGluR6siRNA后，在mRNA和蛋白水平mGluR6的表達量均顯著降低（圖1A，B），證實了mGluR6的過表達載體和mGluR6siRNA是有效的，并將用于后續的細胞功能實驗。2mGluR6對大鼠NSCs增殖的影響我們通過MTT實驗檢測過表達或沉默mGluR6對大鼠NSCs增殖的影響。結果表明，大鼠胚胎NSCs細胞轉染過表達mGluR6質粒48h后，顯著促進了細胞活力（圖2A）；轉染mGluR6siRNA質粒48h后，顯著抑制了細胞活力（圖2B）。為了進一步檢測mGluR6對大鼠神經球增殖的影響，我們測量了神經球直徑，結果表明轉染過表達質粒組的神經球直徑明顯比對照組大（圖3A），而轉染mGluR6siRNA質粒組的神經球明顯小于對照組（圖3B）。這表明mGluR6促進了大鼠NSCs增殖。3mGluR6對大鼠NSCs細胞周期的影響為了研究mGluR6對大鼠NSCs細胞周期的影響，我們將mGluR6過表達和干擾siRNA分別轉染至大鼠NSCs細胞中，通過流式細胞儀進行檢測，結果表明轉染mGluR6過表達質粒后，G1／G0期和細胞比率顯著下降，S期細胞比率顯著上升，促進了細胞周期G1到S期轉換（圖4、5）；而轉染mGluR6siRNA后，G1／G0期和細胞比率顯著增加，S期細胞比率顯著下降，抑制了細胞周期G1到S期轉換（圖6、7）。4mGluR6對大鼠NSCs細胞凋亡的影響為了研究mGluR6對大鼠NSCs細胞凋亡的影響，我們將mGluR6過表達質粒和干擾siRNA分別轉染至大鼠NSCs細胞中。通過流式細胞儀進行檢測，和對照組相比，轉染mGluR6過表達質粒的細胞早凋和晚凋比率均顯著下降（圖8、9）；而轉染mGluR6siRNA的大鼠NSCs早凋和晚凋比率均顯著增加，特別是晚凋比率顯著增強（圖10、11）。

討論

在發育和成熟哺乳動物神經系統中，神經干細胞（Neuralstemcells，NSCs）的研究為中樞神經系統（CNS）的損傷、治療和修復帶來了希望。目前，NSCs已經被廣泛用來治療Huntington病、缺血性中風、脫髓鞘病及腦等CNS疾病，NSCs的治療手段已被廣大同行認可，特別在改善神經損傷、腦缺血以及神經變性紊亂相關疾病后的神經功能［12－16］。研究NSCs并應用在CNS替代治療中，基因調控及蛋白質功能改變對NPCs的增殖起著非常重要的作用。所以，探究NPCs增殖過程中的分子網絡及調控機制在神經系統損傷修復及神經退行性疾病的治療等方面具有重要價值.隨著研究的不斷深入，發現谷氨酸可能通過mGluRs對腦損傷后的神經發生有一定的調控作用［17－18］。本小組前期研究中發現，mGluR3［19］、mGluR5［20］和mGluR7［21］均與NSCs的生物學功能有著密切的關系。mGluR6是代謝性谷氨酸受體第III組的重要成員。自1993年被Nakajima等人報道mGluR6在大鼠視網膜中生物學功能以來［6］，許多研究表明mGluR6在視桿和視錐細胞的突觸傳遞過程中至關重要。最近，Devi等人發現mGluR6在人類黑色素細胞中表達，且能夠促進黑色素的含量［22］。但是，mGluR6是否參與NSCs生長及其調控機制還不清楚，值得進一步深入研究。Zhao等研究發現了mGluR5促進了人胚胎神經干細胞前體細胞的增殖及其機制［20］。為研究mGluR6對神經干細胞生物學功能的影響，本研究選擇以大鼠胚胎神經干細胞（NSCs）為研究材料，通過構建mGluR6過表達和siRNA處理大鼠胚胎NSCs，分析其對細胞增殖的影響。研究發現，mGluR6過表達載體能增加體外培養的大鼠NSCs的細胞活力和神經球的大小。相反，mGluR6siRNA降低了NSCs的細胞活力和神經球的大小。這些研究結果表明，mGluR6可促進體外培養的大鼠胚胎NSCs的增殖。細胞周期中G1向S期的過渡是調節細胞周期的重要節點，當G1／S節點通過后，細胞周期依次進行，然后逐漸回到G1期，這個階段不容易受到其他調節因素［23］的影響。M期表明細胞處于增殖和分裂階段，S期表明細胞開始新一輪的DNA復制和分裂。本研究發現，在mGluR6siRNA處理NSCs后，G1／G0期細胞比率升高，S期細胞比率下降，mGluR6siRNA將人NSCs細胞阻滯在G1／G0期，細胞的DNA復制合成與細胞分裂顯著減少。但與之對應的是，過表達mGluR6后，與對照組相比G1／G0期細胞比率顯著下降，S期細胞比率顯著上升，mGluR6過表達促進了細胞G1到S期轉化。綜上所述，mGluR6同其它mGluRs在促神經發生方面主要可能通過以下功能來實現：①直接的促增殖作用；②促NSCs／神經祖細胞向神經元分化；③促存活、抗凋亡神經保護作用。

作者：王玉玨 辛寧寧 單位：延安大學醫學院醫學影像學專業 咸陽師范學院校醫院