談填埋垃圾生物反應器反硝化特性范文
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摘要:利用模擬生物反應器研究了不同填埋齡垃圾在自身降解產生的有機物量不足時的反硝化特征;并以nirS基因為分子標記，采用“PCR－克隆－測序”、建立基因文庫的方法，探討了反應器內反硝化微生物多樣性特征。結果表明:回灌滲濾液C/N適宜的條件下，不同填埋齡垃圾堆體均可作為厭氧介質進行反硝化作用;各反應器內，反硝化菌種群結構相對單一，多樣性偏低，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是垃圾堆體中生長較穩定的種群，可能在滲濾液反硝化脫氮中發揮著重要作用。
微生物鑒于垃圾堆體本身是厭氧環境，且新鮮的垃圾可提供大量碳源，有研究者提出了生物反應器垃圾堆體滲濾液原位脫氮技術的概念［1－4］。該技術充分利用了垃圾填埋層這一厭氧系統碳源豐富的特征，結合外置硝化裝置，最終實現硝化滲濾液的反硝化脫氮。但不同填埋齡的垃圾在填埋場經過一段時間的物理、化學、生物反應后，有機物逐漸降解，緩慢向無機化和腐殖化方向發展。而利用這些碳源不足的垃圾堆體作為介質，研究不同填埋齡垃圾反應器反硝化性能的研究目前還較少。同時，反硝化微生物因在反硝化過程中發揮著重要作用而被越來越多的人關注，目前的研究結果以及研究技術雖已在一定程度上揭示了反硝化過程的微生物學機制，但大部分是對環境樣品的分析，對廢水處理工藝中的反硝化脫氮機理及微生物多樣性的研究還不多［5－9］。本文選擇裝填4a、8a、12a垃圾的反應器(R4、R8與R12)為試驗對象，用蒸餾水沖洗各反應器內垃圾堆體至COD濃度基本保持穩定，通過回灌入一定C/N的滲濾液，考察不同填埋齡垃圾在自身降解產生的有機物量不足時的反硝化特征，并結合分子生物學技術探討反應器內反硝化微生物多樣性變化規律。
1材料與方法
1.1填埋垃圾生物反應器模擬裝置
填埋垃圾生物反應器模擬裝置高75cm，內徑20cm，由有機玻璃制成。反應器頂部裝有閥門，用于滲濾液回灌;另一閥門裝于反應器底部，用于滲濾液的排出;在反應器不同高度設有均勻分布的3個固體取樣口。具體如圖1所示。本試驗共制作了3個相同模擬裝置，分別裝填了4a、8a、12a垃圾，相應的命名為R4、R8、R12。垃圾裝填前將不可降解的物質如玻璃、塑料等剔除。每個反應器垃圾裝填量約為15kg，密度約為884kg/m3。
1.2試驗設計
在試驗正式開展前，用蒸餾水沖洗各反應器內垃圾堆體至COD濃度基本保持穩定，具體性質如表1示。調節回灌滲濾液原液的硝酸鹽負荷為500mg/L，COD濃度約為4500mg/L(C/N約為9.0)。每個反應器回灌3次，按回灌順序分別稱為Test1、Test2、Test3。定期從反應器底部采集滲濾液樣品，分析相關指標。整個試驗結束后，采集垃圾固體樣品用于微生物多樣性分析。試驗過程中，室溫保持在(28±1)℃。1.3滲濾液樣品分析滲濾液樣品的監測指標主要是COD和NO3－-N。COD的測定采用重鉻酸鉀法;NO3－-N的測定采用分光光度法。具體的測定方法詳見《水與廢水監測分析方法》［10］。1.4nirS克隆文庫的建立采用FastPrepDNA提取試劑盒(QBIOGENE)提取垃圾樣品總DNA。反硝化微生物PCR擴增采用nirS1F，nirS6R引物對，擴增片段長度為890bp［11］。采用25μL反應體系:10×PCRBuffer2.5μL;dNTPs(各2.5mmol/L)1.0μL;MgCl2(25mmol/L)1.5μL;nirS1F(20μmol/L)0.5μL;nirS6R(20μmol/L)0.5μL;Taq酶(5U，Takara)0.3μL;DNA1.0μL;ddwater17.7μL。PCR反應條件:95℃預變性6min;95℃變性30s，60～55℃退火40s，72℃延伸1min，10個循環;95℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，25個循環;72℃延伸7min，4℃保持。陽性克隆的篩選:在37℃培養12～16h的轉化平板上挑取帶有插入片段的白色克隆，轉到新的含Amp的LB平板上，37℃培養12～16h。然后用pMD18-T載體引物RV-M和M13－47作為PCR的引物，驗證篩選的克隆其插入的片段大小是否正確。限制性酶切分析及測序:片斷大小正確的nirS基因PCR產物用HhaⅠ(Takara，Japan)限制性內切酶酶切。基因文庫中每個OTU選擇1～2個代表菌株外送測序。將測序得到的nirS基因序列與NCBIGenBank中的核酸數據進行同源性比對。用Clustalx1.83進行序列比對，用MEGA軟件選擇鄰接法(Neighbor-joininganalysis)構建系統發育樹。Bootstrap檢驗進行1000次取樣。nirS基因文庫的多樣性覆蓋百分率(CoverageC)的計算公式為:C=［1－(n/N)］×100(1)其中n表示基因文庫中只包含一個克隆的OTU數目;N表示基因文庫的克隆總數。稀釋曲線用aRarefactWin軟件繪制。
2結果與討論
2.1垃圾生物反應器反硝化性能研究
根據各反應器NO3－-N濃度的變化情況(圖2)可知，3次回灌過程中，R4、R8、R12均表現出較強的反硝化性能，且反硝化性能差異不大，每個反應器均可在70h左右將500mg/L的硝酸鹽還原完全。整個反硝化過程，各反應器的COD濃度均隨著反應的進行而降低(圖3)。R8、R12COD的消耗量基本相同，而R4的COD在反應后期趨于平緩。由此推測，當回灌入反應器的滲濾液碳源充足時，不同填埋齡的垃圾均可作為厭氧介質進行反硝化作用。
2.2垃圾生物反應器反硝化微生物研究
在回灌實驗結束后，采集R4、R8、R12的垃圾固體樣品，提取總DNA，以亞硝酸還原酶nirS作為分子標記建立基因文庫的方法，探討生物反應器滲濾液反硝化過程中反硝化微生物的群落組成和多樣性變化情況。R4、R8、R12分別建立一個nirS基因文庫，共得到具正確插入片段的克隆217個。通過限制性酶切分型后分析發現，OTUs數目較少，3個nirS基因文庫中共有OTUs29個，微生物群落結構較單一，序列比對后，3個nirS基因文庫中最相似序列均可歸屬于兩大類:變形菌門(Proteobacteria)細菌和未培養微生物(表2)。經計算，R4、R8和R12的多樣性覆蓋率分別為98.8%、95.5%和91.3%，3個基因文庫的覆蓋率均較高;但三者相比較，R12的覆蓋率最低，說明R12的反硝化微生物多樣性略高于R4和R8。由R4、R8和R12的稀釋曲線圖(圖4)可知，R4的稀釋曲線已達到平臺期，而R8和R12的稀釋曲線仍處于上升趨勢，尤其是R12。將獲得的克隆和比對到的最相近已知物種構建系統發育樹，結果如圖5所示。從圖2已知，R4、R8和R12在回灌滲濾液有機物充足的情況下均具有較強的反硝化性能。現從系統發育樹的結果證實，各反應器內均存在著大量反硝化菌，但不同填埋齡垃圾反應器間的反硝化微生物群落結構存在一定差異。結合表3R4、R8和R12各文庫中與相近物種的克隆數分布情況可知:R4nirS文庫中的優勢菌群為Thiobacillusdenitrificans，其克隆豐富度為54.32%;R8、R12nirS文庫中的優勢菌群均為Azoarcustolulyticus，其克隆豐富度分別為71.64%和56.52%。從圖3COD濃度的分析發現，當滲濾液回灌進入垃圾堆體后，隨著反硝化作用的進行，R4反應器的COD濃度在反應后期趨于平緩，與R8和R12相比，其COD下降幅度略低。經過對R4nirS基因文庫的分析發現，可能原因是R4中反硝化菌以化能自養微生物Thiobacillusdenitrificans為主，因此，反硝化過程中消耗的有機物量相對較少。另外，在R8、R12中還檢測到了脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。近幾年對該菌脫氮機理的研究較多，基本已證實Paracoccusdenitrificans無論在好氧還是厭氧環境下都可利用自己獨特的酶系統進行反硝化作用［12－14］。
3結論
1)利用不同填埋齡垃圾作為反硝化作用介質，當垃圾自身降解產生的有機物量不足時，只要提供足夠的碳源，所有垃圾堆體均可作為厭氧處理系統進行反硝化作用，且反硝化性能差異不大。2)對反應器內反硝化微生物種群結構的研究發現，不同填埋齡垃圾生物反應器內的最相似序列均可歸屬于變形菌門(Proteobacteria)細菌和未培養微生物兩大類，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是生長相對較穩定的種群。
作者：吳松維 吳偉祥 單位：衢州學院