談填埋垃圾生物反應(yīng)器反硝化特性范文
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摘要:利用模擬生物反應(yīng)器研究了不同填埋齡垃圾在自身降解產(chǎn)生的有機(jī)物量不足時(shí)的反硝化特征;并以nirS基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，采用“PCR－克隆－測(cè)序”、建立基因文庫(kù)的方法，探討了反應(yīng)器內(nèi)反硝化微生物多樣性特征。結(jié)果表明:回灌滲濾液C/N適宜的條件下，不同填埋齡垃圾堆體均可作為厭氧介質(zhì)進(jìn)行反硝化作用;各反應(yīng)器內(nèi)，反硝化菌種群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，多樣性偏低，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是垃圾堆體中生長(zhǎng)較穩(wěn)定的種群，可能在滲濾液反硝化脫氮中發(fā)揮著重要作用。
關(guān)鍵詞:垃圾生物反應(yīng)器;反硝化性能;反硝化
微生物鑒于垃圾堆體本身是厭氧環(huán)境，且新鮮的垃圾可提供大量碳源，有研究者提出了生物反應(yīng)器垃圾堆體滲濾液原位脫氮技術(shù)的概念［1－4］。該技術(shù)充分利用了垃圾填埋層這一厭氧系統(tǒng)碳源豐富的特征，結(jié)合外置硝化裝置，最終實(shí)現(xiàn)硝化滲濾液的反硝化脫氮。但不同填埋齡的垃圾在填埋場(chǎng)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的物理、化學(xué)、生物反應(yīng)后，有機(jī)物逐漸降解，緩慢向無(wú)機(jī)化和腐殖化方向發(fā)展。而利用這些碳源不足的垃圾堆體作為介質(zhì)，研究不同填埋齡垃圾反應(yīng)器反硝化性能的研究目前還較少。同時(shí)，反硝化微生物因在反硝化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用而被越來(lái)越多的人關(guān)注，目前的研究結(jié)果以及研究技術(shù)雖已在一定程度上揭示了反硝化過(guò)程的微生物學(xué)機(jī)制，但大部分是對(duì)環(huán)境樣品的分析，對(duì)廢水處理工藝中的反硝化脫氮機(jī)理及微生物多樣性的研究還不多［5－9］。本文選擇裝填4a、8a、12a垃圾的反應(yīng)器(R4、R8與R12)為試驗(yàn)對(duì)象，用蒸餾水沖洗各反應(yīng)器內(nèi)垃圾堆體至COD濃度基本保持穩(wěn)定，通過(guò)回灌入一定C/N的滲濾液，考察不同填埋齡垃圾在自身降解產(chǎn)生的有機(jī)物量不足時(shí)的反硝化特征，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)探討反應(yīng)器內(nèi)反硝化微生物多樣性變化規(guī)律。
1材料與方法
1.1填埋垃圾生物反應(yīng)器模擬裝置
填埋垃圾生物反應(yīng)器模擬裝置高75cm，內(nèi)徑20cm，由有機(jī)玻璃制成。反應(yīng)器頂部裝有閥門，用于滲濾液回灌;另一閥門裝于反應(yīng)器底部，用于滲濾液的排出;在反應(yīng)器不同高度設(shè)有均勻分布的3個(gè)固體取樣口。具體如圖1所示。本試驗(yàn)共制作了3個(gè)相同模擬裝置，分別裝填了4a、8a、12a垃圾，相應(yīng)的命名為R4、R8、R12。垃圾裝填前將不可降解的物質(zhì)如玻璃、塑料等剔除。每個(gè)反應(yīng)器垃圾裝填量約為15kg，密度約為884kg/m3。
1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在試驗(yàn)正式開(kāi)展前，用蒸餾水沖洗各反應(yīng)器內(nèi)垃圾堆體至COD濃度基本保持穩(wěn)定，具體性質(zhì)如表1示。調(diào)節(jié)回灌滲濾液原液的硝酸鹽負(fù)荷為500mg/L，COD濃度約為4500mg/L(C/N約為9.0)。每個(gè)反應(yīng)器回灌3次，按回灌順序分別稱為Test1、Test2、Test3。定期從反應(yīng)器底部采集滲濾液樣品，分析相關(guān)指標(biāo)。整個(gè)試驗(yàn)結(jié)束后，采集垃圾固體樣品用于微生物多樣性分析。試驗(yàn)過(guò)程中，室溫保持在(28±1)℃。1.3滲濾液樣品分析滲濾液樣品的監(jiān)測(cè)指標(biāo)主要是COD和NO3－-N。COD的測(cè)定采用重鉻酸鉀法;NO3－-N的測(cè)定采用分光光度法。具體的測(cè)定方法詳見(jiàn)《水與廢水監(jiān)測(cè)分析方法》［10］。1.4nirS克隆文庫(kù)的建立采用FastPrepDNA提取試劑盒(QBIOGENE)提取垃圾樣品總DNA。反硝化微生物PCR擴(kuò)增采用nirS1F，nirS6R引物對(duì)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為890bp［11］。采用25μL反應(yīng)體系:10×PCRBuffer2.5μL;dNTPs(各2.5mmol/L)1.0μL;MgCl2(25mmol/L)1.5μL;nirS1F(20μmol/L)0.5μL;nirS6R(20μmol/L)0.5μL;Taq酶(5U，Takara)0.3μL;DNA1.0μL;ddwater17.7μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性6min;95℃變性30s，60～55℃退火40s，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán);95℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán);72℃延伸7min，4℃保持。陽(yáng)性克隆的篩選:在37℃培養(yǎng)12～16h的轉(zhuǎn)化平板上挑取帶有插入片段的白色克隆，轉(zhuǎn)到新的含Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16h。然后用pMD18-T載體引物RV-M和M13－47作為PCR的引物，驗(yàn)證篩選的克隆其插入的片段大小是否正確。限制性酶切分析及測(cè)序:片斷大小正確的nirS基因PCR產(chǎn)物用HhaⅠ(Takara，Japan)限制性內(nèi)切酶酶切。基因文庫(kù)中每個(gè)OTU選擇1～2個(gè)代表菌株外送測(cè)序。將測(cè)序得到的nirS基因序列與NCBIGenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)。用Clustalx1.83進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA軟件選擇鄰接法(Neighbor-joininganalysis)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)行1000次取樣。nirS基因文庫(kù)的多樣性覆蓋百分率(CoverageC)的計(jì)算公式為:C=［1－(n/N)］×100(1)其中n表示基因文庫(kù)中只包含一個(gè)克隆的OTU數(shù)目;N表示基因文庫(kù)的克隆總數(shù)。稀釋曲線用aRarefactWin軟件繪制。
2結(jié)果與討論
2.1垃圾生物反應(yīng)器反硝化性能研究
根據(jù)各反應(yīng)器NO3－-N濃度的變化情況(圖2)可知，3次回灌過(guò)程中，R4、R8、R12均表現(xiàn)出較強(qiáng)的反硝化性能，且反硝化性能差異不大，每個(gè)反應(yīng)器均可在70h左右將500mg/L的硝酸鹽還原完全。整個(gè)反硝化過(guò)程，各反應(yīng)器的COD濃度均隨著反應(yīng)的進(jìn)行而降低(圖3)。R8、R12COD的消耗量基本相同，而R4的COD在反應(yīng)后期趨于平緩。由此推測(cè)，當(dāng)回灌入反應(yīng)器的滲濾液碳源充足時(shí)，不同填埋齡的垃圾均可作為厭氧介質(zhì)進(jìn)行反硝化作用。
2.2垃圾生物反應(yīng)器反硝化微生物研究
在回灌實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集R4、R8、R12的垃圾固體樣品，提取總DNA，以亞硝酸還原酶nirS作為分子標(biāo)記建立基因文庫(kù)的方法，探討生物反應(yīng)器滲濾液反硝化過(guò)程中反硝化微生物的群落組成和多樣性變化情況。R4、R8、R12分別建立一個(gè)nirS基因文庫(kù)，共得到具正確插入片段的克隆217個(gè)。通過(guò)限制性酶切分型后分析發(fā)現(xiàn)，OTUs數(shù)目較少，3個(gè)nirS基因文庫(kù)中共有OTUs29個(gè)，微生物群落結(jié)構(gòu)較單一，序列比對(duì)后，3個(gè)nirS基因文庫(kù)中最相似序列均可歸屬于兩大類:變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌和未培養(yǎng)微生物(表2)。經(jīng)計(jì)算，R4、R8和R12的多樣性覆蓋率分別為98.8%、95.5%和91.3%，3個(gè)基因文庫(kù)的覆蓋率均較高;但三者相比較，R12的覆蓋率最低，說(shuō)明R12的反硝化微生物多樣性略高于R4和R8。由R4、R8和R12的稀釋曲線圖(圖4)可知，R4的稀釋曲線已達(dá)到平臺(tái)期，而R8和R12的稀釋曲線仍處于上升趨勢(shì)，尤其是R12。將獲得的克隆和比對(duì)到的最相近已知物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。從圖2已知，R4、R8和R12在回灌滲濾液有機(jī)物充足的情況下均具有較強(qiáng)的反硝化性能。現(xiàn)從系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果證實(shí)，各反應(yīng)器內(nèi)均存在著大量反硝化菌，但不同填埋齡垃圾反應(yīng)器間的反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。結(jié)合表3R4、R8和R12各文庫(kù)中與相近物種的克隆數(shù)分布情況可知:R4nirS文庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)菌群為Thiobacillusdenitrificans，其克隆豐富度為54.32%;R8、R12nirS文庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)菌群均為Azoarcustolulyticus，其克隆豐富度分別為71.64%和56.52%。從圖3COD濃度的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滲濾液回灌進(jìn)入垃圾堆體后，隨著反硝化作用的進(jìn)行，R4反應(yīng)器的COD濃度在反應(yīng)后期趨于平緩，與R8和R12相比，其COD下降幅度略低。經(jīng)過(guò)對(duì)R4nirS基因文庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，可能原因是R4中反硝化菌以化能自養(yǎng)微生物Thiobacillusdenitrificans為主，因此，反硝化過(guò)程中消耗的有機(jī)物量相對(duì)較少。另外，在R8、R12中還檢測(cè)到了脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。近幾年對(duì)該菌脫氮機(jī)理的研究較多，基本已證實(shí)Paracoccusdenitrificans無(wú)論在好氧還是厭氧環(huán)境下都可利用自己獨(dú)特的酶系統(tǒng)進(jìn)行反硝化作用［12－14］。
3結(jié)論
1)利用不同填埋齡垃圾作為反硝化作用介質(zhì)，當(dāng)垃圾自身降解產(chǎn)生的有機(jī)物量不足時(shí)，只要提供足夠的碳源，所有垃圾堆體均可作為厭氧處理系統(tǒng)進(jìn)行反硝化作用，且反硝化性能差異不大。2)對(duì)反應(yīng)器內(nèi)反硝化微生物種群結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，不同填埋齡垃圾生物反應(yīng)器內(nèi)的最相似序列均可歸屬于變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌和未培養(yǎng)微生物兩大類，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是生長(zhǎng)相對(duì)較穩(wěn)定的種群。
作者：吳松維 吳偉祥 單位：衢州學(xué)院