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【摘要】目的探討2,4-D和培養基對刺五加愈傷組織和體細胞胚胎生產刺五加苷B、E的影響，建立有利于刺五加苷B、E積累的刺五加體外培養體系。方法將來自同一外植體的刺五加愈傷組織和體細胞胚胎分別誘導增殖或產生次級體胚，HPLC法測定培養物中刺五加苷B、E含量和培養物質量，考察培養物類型、培養基種類和激素對刺五加苷B、E生產的影響。結果體細胞胚胎的質量雖略低于愈傷組織的質量，但體細胞胚胎生產刺五加苷B、E的能力優于愈傷組織。2,4-D對刺五加苷B、E含量影響較小，僅改變了培養物的質量。MS培養基處理中培養物的刺五加苷B、E產量優于1/2MS培養基。結論刺五加體外培養物可以生產刺五加苷B、E，其產量取決于培養物類型、培養基種類和2,4-D濃度。
【關鍵詞】刺五加；刺五加苷B；刺五加苷E；愈傷組織；體細胞胚胎
刺五加EleutherococcussenticosusHarms是我國醫藥珍品，根、莖、葉均可入藥［1］。歷代本草醫藥記載，其有益氣健脾、補腎安神之功效，已載入《中國藥典》（1977年版）。自20世紀70年代末以來以刺五加為原料生產的各種片劑、沖劑、針劑和刺五加參茶等產品遠銷國外，因而使刺五加資源消耗與日俱增［1,2］。經過幾十年掠奪式的采挖，嚴重地破壞了野生刺五加資源；在自然狀態下刺五加結實的株叢少，種子產量低、質量差、傳播力弱、休眠程度深［2］，并且扦插成活率低、插穗來源少、管理程序繁瑣［3］，1992年出版的《中國植物紅皮書》已把刺五加列為了漸危物種。
植物組織、細胞培養具有快速、高效、低成本的優點，因而近年來利用植物組織、細胞培養快速繁殖刺五加的研究成為熱點。目前多數研究集中于刺五加體細胞胚胎發生［4］和人工種子包埋［5］方面，并取得了可喜成果，對莖尖的快速繁殖、遺傳轉化也有初步探索［4］。但關于刺五加的體外培養物生產刺五加主要藥用成分——刺五加苷B、E的研究尚未見報道。本文以刺五加的體外培養物為試材，探討了培養物類型、培養基種類、激素對刺五加苷B、E生產的影響。
1材料與方法
1.1愈傷組織和體細胞胚胎的獲得刺五加野生植株和種子采自吉林省伊通滿族自治縣西葦鎮。種子經層積處理后，將種子的胚剖出，切取胚軸和野生植株萌發15d以內的幼葉、葉柄作為外植體，接種在包含2,4-D1.0mg/L+NAA1.0或2.0mg/LMS培養基上，分別誘導產生愈傷組織或體細胞胚胎［4,6］。
1.2愈傷組織和體細胞胚胎質量的測定
將上述產自同一外植體的愈傷組織和體細胞胚胎分別繼代入添加了0～1.0mg/L2,4-D的MS和1/2MS培養基中誘導愈傷組織增殖、體細胞胚胎產生次級體胚。培養60，120，180，240d時分別取出增殖產生的全部愈傷組織和體細胞胚胎。用重蒸水洗凈粘附的培養基后，置于濾紙上吸干表面水珠，稱取質量。
1.3刺五加苷B、E含量的測定
HP-1100高效液相色譜儀為安捷倫科技有限公司生產，乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。對照品購自中國藥品生物制品檢定所,刺五加苷B編號為111574-200201，刺五加苷E編號為111713-200501。色譜條件：色譜柱：KromasilODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：0.1％磷酸水溶液-乙腈(0→25min，90∶10→80∶20)，流速為0.8ml·min-1；柱溫：室溫。刺五加苷B、苷E的檢測波長分別是220nm及206nm。
取刺五加的體外培養物置于干燥箱中70℃烘干后，粉碎。精密稱取0.5g，置于100ml圓底燒瓶中。參照文獻［7］的方法，加入50％甲醇溶液20ml，回流提取1h，抽濾，濾液用50％甲醇溶解定容至25ml。取濾液適量，12000r·min-1離心5min，上清液作為供試品溶液。測定其刺五加苷B、E的峰面積，根據刺五加苷B的回歸方程Y=64.584X+2.8729,刺五加苷E回歸方程Y=89.603X+23.808，計算刺五加苷B、E含量。
1.4刺五加苷B、E產量的計算公式為：刺五加苷B、E產量(mg)=刺五加苷B、E含量（mg/100g）×培養物質量(g)/100。
2結果
2.1體外培養物類型對刺五加苷B、E產量的影響以相同質量的外植體材料為起始材料，分別按照最佳體細胞胚胎和愈傷組織培養體系經240d培養后誘導產生的愈傷組織和體細胞胚胎的刺五加苷B、E產量如表1所示。
在整個培養過程中，愈傷組織和體細胞胚胎的物質質量隨著培養時間的延長呈現指數增長。在測定的4個時間點上，誘導產生的愈傷組織的質量均大于體細胞胚胎的質量。刺五加苷B、E的含量在愈傷組織培養120d以內逐漸上升，培養時間超過120d后含量維持在穩定狀態；體細胞胚胎自產生開始到培養240d范圍內的刺五加苷B、E含量均差異不大。綜合考慮刺五加苷B、E含量和物質質量兩個因素的變化，體細胞胚胎雖然在總物質質量上均低于愈傷組織，但由于刺五加苷B、E含量較高，因此在相同培養時間內，同質量外植體產生的體細胞胚胎的刺五加苷B、E的產量優于愈傷組織。表1體外培養物類型對刺五加苷B、E產量的影響（略）
2.2激素對刺五加苷B、E產量的影響2,4-D對體細胞胚胎生產刺五加苷的影響如表2所示。刺五加苷B、E產量較高的體細胞胚胎在2,4-D0～1.0mg/L范圍內培養60d內，刺五加苷B、E含量差異不顯著，因此刺五加苷B、E的產量主要受激素對體細胞胚胎質量的影響。2,4-D濃度為0或0.1mg/L時體外先期產生的體細胞胚胎逐漸產生大量次級體細胞胚胎，而0.5，1.0mg/L的情況下次級體胚產生量極少，同時早期產生的體胚出現畸形現象。在1.0mg/L的2,4-D的處理中，原有體細胞胚胎與培養基接觸處逐漸產生愈傷組織，該愈傷組織整體繼代入不含2,4-D的MS培養基后可產生新的體細胞胚胎，但其產生量較少。表22,4-D對刺五加體細胞胚胎中刺五加苷B、E含量的影響（略）
2.3培養基對刺五加苷B、E產量的影響MS培養基和1/2MS培養基處理培養60d后，對刺五加苷B、E產量的影響如表3所示。
MS培養基處理中體細胞胚胎的刺五加苷B含量顯著高于1/2MS培養基處理的含量，刺五加苷E含量在兩者之間差異不大。MS培養基中培養物質量略高于1/2MS培養基。在相同條件下培養60d后MS培養基的刺五加苷B、E產量略優于1/2MS培養基的處理。表3培養基類型對刺五加苷B、E產量的影響（略）
3討論
利用組織培養生產藥用植物次生代謝產物過程中，一般來講，利用疏松易碎，生長速度快，利于懸浮培養的愈傷組織作為體外培養物較為多見，如紅豆杉、茜草等［8］。刺五加在體外培養過程中較容易形成愈傷組織，接種后2周，即從切口處即可見淡黃色、顆粒狀的愈傷組織產生，4周后整個外植體完全被愈傷組織所覆蓋。將之每隔4周繼代入相同培養基，可使其長期保持生命力［9］。但與其他植物不同的是，刺五加具備較好的愈傷組織發生能力的同時也具有良好的體細胞胚胎發生能力，且其體細胞胚胎自產生的同時其上即可產生大量的次級體細胞胚胎，次級體胚能繼續產生三級、四級體胚［4］，加之體細胞胚胎中刺五加苷B、E含量較之愈傷組織更高，因此利用體細胞胚胎生產刺五加苷B、E更為便利。
在多數植物中，2,4-D只對胚性細胞或細胞團的形成起到誘導作用，而對體細胞胚胎的進一步發育與生長卻是抑制的因素。但對于刺五加而言，不管其體胚發生途徑如何，2,4-D對胚性細胞的誘導及體胚的分化均起到了促進作用［4］，而不同濃度處理中的刺五加苷B、E含量和質量間差異不大，因此對于利用體細胞胚胎生產刺五加苷B、E而言，從成本的角度出發，未添加激素的培養基較為適宜。
MS培養基較之1/2MS培養基，大量元素增加1倍，其它成分相同。即在其它條件相當的情況下MS培養基中N源為1/2MS培養基的2倍。與天山雪蓮組織培養中，提高培養基中NH4NO3濃度，有利于愈傷組織生長和總黃酮的形成相似［10］，MS培養基中刺五加的體細胞胚胎質量和刺五加苷B、E含量均略優于1/2MS培養基的處理。新晨：
【參考文獻】
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