天山花楸葉中總黃酮范文

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【摘要】目的研究天山花楸中總黃酮最佳提取工藝。方法采用正交實驗，分別以比色法測定總黃酮提出率和高效液相色譜（HPLC）圖譜中總黃酮相對積分峰面積為指標(biāo)，考察提取溫度、料液比、醇濃度對天山花楸葉中總黃酮提出率的影響。結(jié)果最終確定天山花楸葉中總黃酮的最佳提取條件為：溫度60℃，醇濃度為60％，料液比1∶10(g∶ml)，其中超聲功率60kHz，時間30min，在相同條件下連續(xù)提取兩次。結(jié)論該提取工藝合理，總黃酮提取率高，質(zhì)量易于控制。

【關(guān)鍵詞】天山花楸；超聲提取；總黃酮；高效液相色譜圖譜；相對積分峰面積

天山花楸SorbustianshanicaRupr為薔薇科(Rosaceae)花楸屬植物(Sorbus)，系新疆維吾爾族和哈薩克族民間用藥，常用于治療肺結(jié)核、哮喘、咳嗽、胃痛等癥［1］。實驗研究表明天山花楸葉具有平喘鎮(zhèn)咳祛痰、依賴性地抑制心肌收縮和保護(hù)心肌缺血等作用［2］。本課題組藥效篩選實驗發(fā)現(xiàn)天山花楸中有效成分主要為黃酮類化合物。

天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，是許多中草藥的有效成分，具有很高的藥用價值。黃酮類化合物具有消除疲勞、保護(hù)血管、預(yù)防動脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能［3］。藥理作用表現(xiàn)為抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒，抗輻射、抗癌抗腫瘤［4］，抗氧化、抗衰老、抗心腦血管疾病［5］，免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松等。傳統(tǒng)的黃酮提取方法有浸漬法、索氏法、回流法等，提取時間較長,并影響提出率。超聲提取是目前比較新的技術(shù)，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，都可加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高了有效成分提出率,縮短了提取時間，節(jié)約了溶劑，并且避免了高溫對有效成分的影響［6］，因此把超聲技術(shù)用于中藥有效成分的提取越來越受到重視。

1材料

美國AgilentHP1100型高效液相色譜系統(tǒng)（配有：四元泵，紫外檢測器，HP1100化學(xué)工作站）；日本島津UV2401（PC）紫外光譜儀；德國SartoriusBP211D十萬分之一電子分析天平；SK5200HP超聲清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，磷酸、乙醇及其它試劑均為分析純；蘆丁對照品由中國藥品生物制品鑒定所提供；天山花楸供試品采自新疆瑪納斯林場，海拔2000～2500m，由石河子大學(xué)藥學(xué)院成玉懷高級實驗師鑒定為薔薇科(Rosaceae)花楸屬植物(Sorbus)。

2方法與結(jié)果

2.1亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測樣品中總黃酮含量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取蘆丁對照品20mg于50ml量瓶中，超聲溶解，用60％乙醇定容至刻度，搖勻備用。分別精密移取上述對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸鋁溶液1.0ml放置6min，加入5％氫氧化鈉試液10ml定容，放置15min后以試劑空白為參比溶液于510nm測吸光度。得回歸方程為：Y＝12.058X－0.0028，r＝0.9999，蘆丁在0.0162～0.0727mg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。其平均加樣回收率為98.0％；RSD(n=3)為0.95%。

2.2HPLC分析

2.2.1色譜條件WatersC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；檢測波長360nm；溫度25℃；運(yùn)行時間30min；平衡時間10min；進(jìn)樣量20μl，梯度洗脫條件見表1。表1HPLC梯度條件（略）

2.2.2HPLC圖譜在上述HPLC色譜條件下，樣品中各組分的色譜峰分離度良好。結(jié)果見圖1。

2.2.3HPLC分析指標(biāo)建立本課題組藥理實驗證明，醋酸乙酯提取物為藥理實驗有效部位。經(jīng)理化鑒定及TLC分析結(jié)果顯示該有效部位呈黃酮類化合物陽性反應(yīng)。通過對比圖1中各樣品HPLC圖譜，在20～30min其共有峰保留時間和整體圖貌具有良好的一致性。色譜分析中，化合物保留時間，取決于化合物特定的色譜行為，可以確定20～30min一系列色譜峰為黃酮類化合物色譜峰。因此，本實驗選擇積分HPLC圖譜20～30min各組分色譜峰，計算相對積分峰面積（各組分積分峰面之和與樣品質(zhì)量的比值，記作：A/μg），對指標(biāo)進(jìn)行量化，并以此分析樣品。

2.3正交實驗設(shè)計結(jié)合預(yù)實驗實際情況，選提取溫度（A）、料液比（B）和乙醇濃度（C）為影響總黃酮提出的主要因素，每個因素取3個水平（見表2），選用L9（34）正交實驗表安排實驗，其中超聲功率60kHz，時間30min，連續(xù)提取兩次。精確稱取天山花楸葉干粉2.0g，加入不同溶劑系統(tǒng)，平行提取條件下操作，按“2.1”項測定并計算總黃酮含量及相對積分峰面積。

表2因素水平

2.4正交實驗結(jié)果及分析

由表3～4結(jié)果分析表明，以總黃酮含量為指標(biāo)時，因素A對總黃酮提取實驗影響顯著，影響順序為A>B>C，最佳提取工藝條件為A2B3C3；由表3，表5分析表明，以HPLC圖譜相對積分峰面積為指標(biāo)時，因素A、C對總黃酮提取實驗影響顯著，影響順序為A>C>B，最佳提取工藝條件為A3B1C2。表3結(jié)果與極差分析（略）表4總黃酮含量為指標(biāo)方差分析（略）表5相對積分峰面積為指標(biāo)方差分析（略）

2.5最佳工藝條件驗證實驗通過以上實驗，綜合分析考慮，最終選用相對積分峰面積為指標(biāo)，最佳提取工藝條件確定為A3B2C2，即提取溫度為60℃，料液比為1/10g/ml，乙醇濃度為60％，其中超聲功率60Hz，時間30min，連續(xù)提取兩次。在此最佳工藝條件下平行進(jìn)行3次實驗，總黃酮提取率較高且穩(wěn)定。

3討論

3.1浸提溶劑的選擇

黃酮類化合物的游離黃酮苷元和黃酮苷極性皆較大，因此較易溶于極性較大甲醇和乙醇以及相應(yīng)的水溶液中，提出率較高；而醋酸乙酯和丙酮極性較小，相對提出率較低。乙醇相對甲醇而言毒性小，且本身具有殺菌作用，提取樣品不易發(fā)霉變質(zhì)，所以本實驗選取乙醇為提取溶劑。

3.2檢測波長的確定

精密移取蘆丁對照品溶液2.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸鋁溶液1.0ml放置6min，加入5％氫氧化鈉試液10ml定容，放置15min后于400～800nm波長范圍進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，蘆丁顯色后在510nm處有最大吸收峰。

3.3顯色條件考察

在預(yù)實驗中參考有關(guān)文獻(xiàn)的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量時，發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)樣品吸光度值變化較大，準(zhǔn)確度、精密度、重現(xiàn)性及回收率結(jié)果均較差。故本實驗又重新考察了顯色劑加入量、顯色溫度和顯色時間，對比色條件進(jìn)行了改進(jìn)，確立了新的測定條件，即“2.1”項中測樣品中總黃酮含量的方法。經(jīng)重復(fù)性、回收率等實驗分析表明，以此方法測定天山花楸中總黃酮含量，能夠取得較為滿意的結(jié)果。

3.4分析指標(biāo)的確定

本實驗以蘆丁為對照品加入顯色劑于400～800nm波長范圍內(nèi)掃描，其在510nm具有最大吸收，主要原因是其具有鄰二酚羥基可與顯色劑顯色。但天山花楸葉醇提液中，除含有黃酮類化合物，綠原酸含量也較高［7］。綠原酸也具有鄰二酚羥基可與顯色劑顯色，對天山花楸葉中總黃酮含量測定產(chǎn)生干擾［8］。實驗表明以蘆丁為對照品，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑，在510nm測定天山花楸葉醇提液中總黃酮含量的方法專屬性不強(qiáng)、有局限性、準(zhǔn)確性較差。而HPLC圖譜顯示，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，可以避免樣品中其它組分干擾目標(biāo)化合物的分析，專屬性較強(qiáng)。且經(jīng)初步實驗驗證20～30min為一系列黃酮類化合物的色譜峰。因此，本實驗選擇以HPLC圖譜20～30min相對積分峰面積為指標(biāo)來分析天山花楸葉提取樣品。

3.5最佳工藝條件的確定

通過實驗，以HPLC圖譜中總黃酮相對積分峰面積為指標(biāo)，確定了天山花楸葉中總黃酮的最佳提取工藝條件，其中料液比為1/8g·ml-1。但考慮到干燥花楸葉粉末吸水性較大，影響樣品流動性，不利于循環(huán)超聲提取，且由表5可知，料液比對總黃酮的提取無顯著性影響，綜合分析考慮將料液比確定為1/10g·ml-1。

3.6結(jié)論

與比色法測定總黃酮含量為指標(biāo)相比，以HPLC圖譜中黃酮類化合物相對積分峰面積為指標(biāo)對樣品的分析方法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等特點，易于生藥及制劑質(zhì)量控制。以其確定的天山花楸葉總黃酮提取工藝合理，提取率穩(wěn)定。新晨：

【參考文獻(xiàn)】

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