FAK在白血病中的應(yīng)用范文

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作者：闞玉玲管洪在單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)教研室

基因提取及擴(kuò)增方法

1單個(gè)核細(xì)胞（MNC）的分離

在無(wú)菌條件下采集骨髓液2mL，EDTA抗凝，用Ficoii淋巴細(xì)胞分離液（相對(duì)密度1．077）分離MNC，用1×PBS洗滌2～3次。－80℃凍存?zhèn)溆没蛑苯犹崛NA。

2總RNA的提取

用原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司提供的RNApure超純總RNA離心柱式試劑盒提取RNA。經(jīng)紫外線(xiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度（A260／A280＞1．6），同時(shí)進(jìn)行RNA定量測(cè)定。在15g／L瓊脂糖凝膠上電泳可見(jiàn)3條清晰亮帶，說(shuō)明所提取RNA完整。

3cDNA合成

應(yīng)用M－MVL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20mL，包括總RNA1μg，0．5g／L的OLigo（dT）primer1μL，使用DEPC水補(bǔ)充至12μL?？焖偎矔r(shí)離心，置65℃孵育5min，立即置于冰上；然后依次加入55×緩沖液4μL，RNase抑制劑1μL，10mmoL／LdNTPMix2μL，混勻，42℃2min；再加入逆轉(zhuǎn)錄酶（M－MLV）1μL，42℃反應(yīng)30min，70℃下放置10min，冰上5min。

4PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μL，20μmol／L的fak正、反義鏈引物各1μL，2×PCRMix10μL（其中包括10mmol／L的dNTPs、10×緩沖液、TaqDNA聚合酶），其余以DEPC水補(bǔ)足至20μL。所用引物根據(jù)GenBank提供的FAKmRNA序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。

FAK正義鏈為5′－TATTGGACCTGCGAGGGAT－TGG－3′，反義鏈為5′－GAGGCGGTTTCTTTGGT－GGAGC－3′，目的基因長(zhǎng)度為255bp。β－actin正義鏈為5′－AAACACCCCAGCCATGTACGT－3′反義鏈為5′－GTGGTGGTGAAGCTGTAGC－3′，目的基因長(zhǎng)度為228bp。內(nèi)參照與目的基因分別擴(kuò)增，PCR條件：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。

5PCR產(chǎn)物分析

取PCR產(chǎn)物10μL與LoadingBuffer2μL混合，在15g／L瓊脂糖凝膠中電泳，80V恒壓電泳25min，EB染色。陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)228、255bp處各有一條亮帶，分別為β－actin和FAK。紫外線(xiàn)透射儀觀(guān)察并照相，照片經(jīng)Meta－morphImagingSight軟件進(jìn)行分析并讀取吸光度值，取FAK與β－actin曲線(xiàn)下面積的比值作為FAKmRNA的相對(duì)含量。

染色體的制備及R顯帶和核型分析

1染色體的制備將白血病病人骨髓細(xì)胞按（1～2）×109／L的密度接種于RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，加入0．05mg／L秋水酰胺，37℃孵育1h。1000r／min離心10min，棄上清液，加入預(yù)溫至37℃的0．075mol／LKCl溶液8mL，37℃孵育30min進(jìn)行低滲。加入1mL固定液（甲酸∶乙醇＝3∶1）輕輕混勻進(jìn)行預(yù)固定，離心后再進(jìn)行3次固定，將最后一次固定的標(biāo)本以1000r／min離心10min，棄上清液，加入適量固定液配成細(xì)胞懸液，備用。

2染色體R顯帶采用氣干法制片，將制備好的片子晾干，放入R顯帶液中，87．5℃水浴70～80min。取出片子水洗，晾干，再加Giemsa液染色15min，水洗，干后鏡檢。

3染色體核型分析每例病人分析10～20個(gè)分裂中期細(xì)胞，觀(guān)察有無(wú)染色體異常。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組率比較用χ2檢驗(yàn)和精確概率檢驗(yàn)；計(jì)量數(shù)據(jù)以x珚±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié)果

1FAKmRNA在AL病人骨髓MNC中的表達(dá)

AL病人FAKmRNA陽(yáng)性表達(dá)率為66．0％，與正常對(duì)照組（20．0％）比較差異有顯著意義（χ2＝5．49，P＜0．05）。其中ALL和ANLL病人陽(yáng)性表達(dá)率分別為71．4％和63．9％，二者差異無(wú)顯著意義（P＞0．05），但兩者均高于正常對(duì)照組（P＝0．04；χ2＝4．44，P＜0．05）。ALL和ANLL病人FAKmRNA的表達(dá)水平分別為0．75±0．12和0．65±0．17，二者差異無(wú)顯著性（P＞0．05），但與正常對(duì)照組（0．31±0．15）比較，差異有顯著意義（t＝7．98、5．60，P＜0．05）。部分病人電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2FAKmRNA在不同時(shí)期AL病人的表達(dá)

初診組和復(fù)發(fā)組AL病人白血病細(xì)胞FAKmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80．0％、85．7％，兩組比較差異無(wú)顯著性（P＞0．05），但均高于正常對(duì)照組（χ2＝9．38，P＜0．05；P＝0．02）。初診組和復(fù)發(fā)組AL病人白血病細(xì)胞FAKmRNA表達(dá)水平分別為0．72±0．12、0．87±0．15，兩組比較差異無(wú)顯著意義（P＞0．05），但均高于正常對(duì)照組（t＝8．79、7．58，P＜0．05）。緩解組病人FAKmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為23．1％，均明顯低于初診組和復(fù)發(fā)組，差異均有顯著意義（χ2＝10．26，P＜0．05；P＝0．02）；與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P＞0．05）。緩解組病人FAKmRNA表達(dá)水平為0．27±0．17，明顯低于初診組和復(fù)發(fā)組（t＝4．44、7．82，P＜0．05），與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P＞0．05）。

3FAKmRNA的表達(dá)與骨髓細(xì)胞染色體核型的關(guān)系

AL病人骨髓細(xì)胞染色體異常核型的檢出率為64．0％（32／50）。FAKmRNA在異常核型組的陽(yáng)性表達(dá)率為78．1％，明顯高于異常核型未檢出組的44．4％（χ2＝5．82，P＜0．05）；FAKmRNA在異常核型組的表達(dá)水平為0．75±1．17，明顯高于異常核型未檢出組的0．45±0．11（t＝6．72，P＜0．05）。

討論

FAK是SCHALLER等于1992年發(fā)現(xiàn)的能使Src內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，在絲氨酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的磷酸化蛋白中發(fā)現(xiàn)。FAK廣泛分布于成纖維細(xì)胞、血小板、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、TC、BC、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞等的細(xì)胞質(zhì)中。已知FAK有6個(gè)可以被磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)，F(xiàn)AK主要通過(guò)這些位點(diǎn)的磷酸化并與含有SH2或SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)整合素、FAK／Src／Pl30CAS／JNK、FAK／PI3激酶以及FAK－ROCK／RhoA等多條信號(hào)通路參與細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移。

白血病是遺傳學(xué)和表型上異質(zhì)性疾病，為多種癌基因、抑癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)失衡等協(xié)同作用的結(jié)果。迄今，有關(guān)FAK與白血病相關(guān)性研究報(bào)道較少。

2004年RECHER等報(bào)道，在AML中發(fā)現(xiàn)有FAK蛋白的高表達(dá)和過(guò)度激活，并提示FAK的高表達(dá)與白血病細(xì)胞的遷移、預(yù)后及耐藥性有關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，AL病人FAK基因的表達(dá)率、表達(dá)水平均明顯升高，其升高的具體機(jī)制不是十分清楚。先前有研究結(jié)果表明，F(xiàn)AK的磷酸化受到整合素、細(xì)胞因子、致癌基因和酪氨酸激酶受體的調(diào)節(jié)。異常整合素或細(xì)胞因子的信號(hào)通路以及Ras等致癌基因產(chǎn)物的表達(dá)均可以導(dǎo)致AML細(xì)胞中FAK的磷酸化，從而進(jìn)一步導(dǎo)致下游一系列信號(hào)通路的持續(xù)激活。另外有研究結(jié)果顯示，在AML細(xì)胞中20％的病人有8q22－8q24染色體區(qū)域擴(kuò)增，而這個(gè)區(qū)域正是FAK基因所在，因此，8q的擴(kuò)增可能與FAK在ANLL細(xì)胞異常表達(dá)有關(guān)系。

FAK與血液系統(tǒng)中B細(xì)胞成熟過(guò)程也有關(guān)系，LE等研究顯示，F(xiàn)AK是CXCL12－CXCR4軸的下游信號(hào)分子，并介導(dǎo)細(xì)胞的黏附作用。CXCL12誘導(dǎo)未成熟B細(xì)胞FAK蛋白磷酸化，通過(guò)PKC等信號(hào)共同調(diào)控細(xì)胞的成熟與運(yùn)動(dòng)。有關(guān)FAK基因在ALL表達(dá)增高的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果還顯示，初診組和復(fù)發(fā)組病人白血病細(xì)胞FAK基因的表達(dá)率和表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高，而緩解組則明顯降低，推測(cè)FAK基因表達(dá)與白血病的病情進(jìn)展有關(guān)，是預(yù)后不良的因素之一。TARDY等最近研究顯示，AML病人白血病細(xì)胞中FAK蛋白高表達(dá)則其預(yù)后相對(duì)較差。本文結(jié)果與TARDY等的研究結(jié)果一致，說(shuō)明FAK是影響白血病病人生存率的重要因素之一。

LE等采用BCR－ABL－BaF3細(xì)胞系（一種BCR－ABL基因轉(zhuǎn)染的前B淋巴細(xì)胞）研究顯示，F(xiàn)AK基因沉默技術(shù)使細(xì)胞的增殖和克隆形成均減少，中位生存期延長(zhǎng)，且伊馬替尼對(duì)BCR－ABL細(xì)胞的療效增加。這表明FAK對(duì)ALL的進(jìn)展具有一定的促進(jìn)作用。FAK的高表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞黏附后的失巢凋亡，導(dǎo)致癌細(xì)胞以非錨定生長(zhǎng)方式不斷增殖，這有助于腫瘤細(xì)胞的存活和侵襲轉(zhuǎn)移。

FAK的高表達(dá)可能是造成白血病細(xì)胞耐藥的又一重要因素。不同種類(lèi)的白血病常有各自的特征性染色體異常，因此染色體檢查有助于白血病的診斷和預(yù)后判定。本研究顯示，異常核型檢出組FAKmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)水平明顯高于未檢出組，表明該基因的表達(dá)與染色體的改變具有內(nèi)在聯(lián)系。磷酸化FAK表達(dá)上調(diào)在細(xì)胞基因突變中起著重要作用，它能夠上調(diào)細(xì)胞增殖、擾亂細(xì)胞間的接觸抑制、抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的侵襲以及血管生成等。染色體異常病人FAKmRNA表達(dá)增高可能是由于基因插入、缺失等原因激活了該基因的表達(dá)，但是具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

許呂宏等成功構(gòu)建FAKshRNA慢病毒載體，發(fā)現(xiàn)基因沉默技術(shù)可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。提示抑制該基因會(huì)在源頭上阻止白血病的發(fā)生。另外，選擇FAK抑制劑FIP200等或選擇性抑制FAK的催化活性均可抑制FAK的功能，從而阻斷多條與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路。這可能是更加接近針對(duì)白血病本質(zhì)的治療策略，F(xiàn)AK可能是白血病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。