伯氏瘧原蟲哌喹抗性系病理學特征及抗性研究范文

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摘要：

目的觀察伯氏瘧原蟲（Pb）ANKA株哌喹抗性系（PQR）感染小鼠組織病理學變化特征，比較與哌喹敏感系（PQS）的差異，探討其抗性機制。方法實驗小鼠隨機分為A（PQS）、B（PQR）及C（正常對照，NC）三組，取肝、脾、腦及腎組織，10%福爾馬林固定后石蠟包埋，4μm切片，蘇木精一伊紅（Haematoxylin-eosin,HE）及吉姆薩（Giemsa）染色，鏡下觀察其組織病理學改變。結果與PQS組比較，PQR組瘧原蟲感染紅細胞（pRBC）及瘧色素（HZ）在各器官組織中出現晚，增殖緩慢，數量明顯偏少，在17d增至峰值時仍明顯少于PQS組6d時，22d時開始下降。各組織的炎性病變隨感染天數的延長而變化：早期較輕，呈漸進性發展，17d時達到高峰，22d時炎癥減輕，組織損傷呈恢復趨勢，其兩組肝、脾組織中炎性細胞的浸潤程度在6d時未見明顯不同。腦組織的炎性反應、瘧原蟲浸潤及組織損傷程度均顯著輕于PQS組。結論PQR系的毒力下降、致病力降低表象的組織病理學特征為：肝、脾、腦和腎組織中pRBC及HZ浸潤量明顯偏低，炎性反應、原蟲數量的變化呈逐漸增加、降低、趨向恢復的動態過程，未見明顯的腦型瘧的組織學變化。

關鍵詞：

伯氏瘧原蟲；哌喹抗性；瘧色素；組織病理學；蘇木精-伊紅染色法

磷酸哌喹（Piperaquinephosphate,PQ）是瘧疾防治的主要藥物，單用容易產生抗藥性，世界衛生組織提出與青蒿素的衍生物雙氫青蒿素配伍制成的復方藥物-科泰復，是目前流行區抗瘧的主要一線藥物[1]。盡管復方藥物的應用已有效延緩了瘧原蟲對抗瘧藥抗性的產生，但對瘧原蟲抗性機制研究依然迫在眉睫，PQ的抗性機制亟待闡明。在前期的PQ抗性機制研究中，課題組通過對伯氏瘧原蟲（Plasmodiumberghei，Pb）ANKA株哌喹敏感株（PQsensitive,PQS）感染小鼠采用PQ連續加壓的方法，建立了Pb抗哌喹（PQresistant，PQR）系感染小鼠模型[2]。觀察發現，隨著抗性的產生，PQR模型小鼠瘧原蟲毒力明顯減弱，致病力下降，對小鼠影響由致死性變為生存期顯著延長甚至存活[2]；感染小鼠的脾淋巴細胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均顯著高于PbANKA株PQS系感染小鼠，并可誘導小鼠產生一定保護性免疫反應[3]；進一步觀察發現，感染早期6d時脾細胞中TNF-a及INF-γ細胞因子分泌細胞數量在PQR組明顯高于PQS組[4]。PbANKA株對PQ產生抗性后對小鼠主要組織器官所造成的影響及其組織病理學特征如何？據研究資料報道，惡性瘧原蟲感染可造成嚴重的組織器官病理損害及功能障礙或導致腦型瘧的發生，是瘧疾病人死亡的重要原因之一[5-7]。由此推測，PQR系感染小鼠組織病理學損傷與致死性PQS系感染小鼠相比可能不同。本文利用該鼠瘧模型，通過常規蘇木精—伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法并輔以對組織中的瘧原蟲有良好染色效果的優化吉姆薩（Giemsa）組織染色法[8]，對PQR組以及PQS組感染小鼠的肝、脾、腦和腎組織進行了病理組織形態學觀察，旨在通過比較PQR與PQS感染小鼠組織病理學變化特點及差異，從組織學的角度探討瘧原蟲對PQ的抗性相關機制，為PQR抗性相關感染免疫調節機制的闡明，提供進一步的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1PbPQS和PbPQR

PbPQS系由海南省熱帶病重點實驗室惠贈，以低溫冷凍和鼠間血傳交替保種；PbPQR系由海南醫學院科學實驗中心建立及保種[2]。

1.1.2實驗動物及分組

80只雄性瑞士種昆明遠交系小鼠購自廣州中山大學實驗動物中心，6~8周齡，體重為（25±2）g。隨機分為3組，即A組（PQS組）10只、B組（PQR組）和C組（正常對照組，NC）各35只。1.1.3試劑吉姆薩（Giemsa）粉劑購自國藥集團化學有限公司，蘇木素（Hematoxylin）、伊紅（Eosin）購自阿拉丁試劑公司。1.2方法1.2.1實驗動物感染A、B組分別腹腔感染PQS系和PQR系1×107個紅內期原蟲（200μL血），C組腹腔注射200μL生理鹽水。A組小鼠在感染后3、6d,B、C組小鼠在感染后3，6，9，12，15，17及22d脫頸處死，取肝、脾、腦和腎組織制片。

1.2.2染液配制

HE染液采用改良Carazzi蘇木素染液配制法配制[9]。Giemsa染液原液根據文獻[10]配制后，用pH6.8的磷酸鹽緩沖液30倍稀釋后做為組織切片染色液[8]。

1.2.3HE染色方法

小鼠肝、脾、腦及腎組織經石蠟包埋后4μm切片，60℃烤箱30min，二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染液中5min，水沖洗，1%鹽酸乙醇中分化3s，水沖洗，pH7.2PBS中返藍30s，水沖洗，1%伊紅中染色20s，水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封固后鏡檢。

1.2.4Giemsa染色方法

組織切片的Giemsa染色脫蠟、水化過程與HE染色同，其染色為30倍稀釋染液室溫染色5min，水沖洗，水溶性封片劑封固后鏡檢。1.2.5分析方法采用半定量的方法對pRBC、HZ及炎性細胞的組織中浸潤程度進行分析判斷，每個標本隨機選擇5個高倍（×400）及油鏡（×1000）視野觀察分析，每組取5個標本的均數作為該組的半定量結果。

2結果

2.1感染小鼠一般情況PQS組

小鼠感染6d時均出現體重下降，精神萎靡、縮頭不動，皮毛松弛、尾巴發青觸及無熱度、對外界刺激反應下降等瀕死癥狀；PQR組小鼠感染6d未見明顯變化，僅個別鼠在感染17d后出現上述癥狀。

2.2正常對照組組織HE及Giemsa染色鏡檢正常對照小鼠（C組）肝、脾、腦及腎組織光學顯微鏡下結構正常，組織細胞輪廓清晰完整，見圖1A、圖2A、圖3A、圖4A。

2.3PQS和PQR組肝臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時可見肝竇輕度充血，肝細胞水腫，局部呈顆粒或氣球樣變性，肝竇及匯管區可見明顯的中性、淋巴、單核等炎性細胞浸潤，個別成團分布，枯否氏細胞增生，可見個別位于紅細胞內的瘧原蟲（ParasitisedRedBloodCell，pRBC）及瘧色素（MalariaPigmentHemozoin，HZ）顆粒。6d時肝細胞變性、肝竇充血加重，以淋巴細胞、單核細胞為主的炎性細胞大量增加，肝竇內可見大量的pRBC及呈點狀或團塊狀分布的HZ，枯否氏細胞數量明顯增多，體積增大，大量細胞胞漿內吞噬有瘧原蟲、大小不等的HZ顆粒及紅細胞碎片；PQR組肝竇及匯管區的中性、淋巴、單核以及枯否氏細胞浸潤從3d時開始逐漸增加，感染第6、9d時，炎性細胞以淋巴及單核細胞增加為主，少量中性粒細胞，偶見個別pRBC；9d開始可見局部肝組織充血，并逐漸加重，個別肝細胞結構疏松，體積增大，水腫變性；12d時其匯管區及肝小葉邊緣區炎性細胞浸潤更為明顯，單核細胞比例進一步增加，個別樣本的部分肝小葉結構破壞，pRBC或瘧原蟲及HZ增加，部分聚集成團，枯否氏細胞對其吞噬活躍；17d時以上變化達到高峰，22d時炎性反應、pRBC及HZ明顯降低，浸潤細胞以單核細胞為主,見圖1、表1。

2.4PQS和PQR組脾臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時鏡下可見白髓增大，淋巴細胞增加，脾竇內可見少量pRBC及HZ顆粒。6d時白髓繼續增大，部分紅、白髓界限不清，可見大量pRBC、HZ及紅細胞碎片，HZ呈顆粒狀或成團分布，巨噬細胞增多，內見吞噬的瘧原蟲、HZ與紅細胞碎片。PQR組3d鏡下可見個別脾臟白髓增大，其他未見明顯變化，6d時可見個別pRBC，巨噬細胞增加，9d時脾臟充血嚴重，個別紅、白髓界限不清，巨噬細胞大量增加，體積增大，胞體內可見吞噬的瘧原蟲、HZ和紅細胞碎片，12d時pRBC及HZ進一步增加，15d始可見網狀細胞逐漸增加，以上的變化除網狀細胞外至17d時達到峰值，22d時脾臟的炎性細胞浸潤減輕，pRBC及HZ明顯減少，網狀細胞未見下降,見圖2、表1。

2.5PQS和PQR組腦組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時鏡下可見軟腦膜下及皮質組織內毛細血管充血，偶見pRBC。6d時充血進一步加重，pRBC及HZ浸潤增加，毛細血管及小血管內pRBC及不含原蟲的紅細胞聚集，并可見與血管內皮細胞粘附，局部腦組織可見小出血點，多量單核、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。PQR組3、6d未見明顯變化，9d時可見局部腦組織結構疏松水腫，毛細血管充血，少數炎性細胞浸潤，偶見pRBC；炎性細胞在17d時達到最高，并從早期以淋巴細胞為主轉為以單核細胞為主，可見個別瘧原蟲；22d時水腫減輕，炎性細胞明顯減少，偶見個別瘧原蟲,見圖3和表1。

2.6PQS和PQR組腎臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d局部組織腎小球及腎間質內毛細血管充血擴張，可見個別pRBC。6d時充血加重，部分腎組織極度充血，腎小管細胞水腫，腎小管管腔變小，部分樣本大片腎臟組織結構破壞及腎小管細胞壞死，腎小球、腎小管及間質內可見明顯的淋巴、單核-巨噬細胞浸潤及大量pRBC及HZ。PQR組鏡下3d未見明顯變化，6d時可見個別炎性細胞浸潤，隨后逐漸增加，12d時可見個別pRBC及HZ，局部組織充血，至17d時充血更為嚴重，淋巴、單核-巨噬細胞、pRBC及HZ增至峰值，并可見部分腎小球擴大，22d時腎組織炎性細胞浸潤減少，充血明顯減輕或基本消失，pRBC及HZ浸潤亦明顯下降，見圖4、表1。

3討論

PbANKAPQR小鼠顯著的生物學特征是病變癥狀輕，原蟲感染率低，存活時間長甚至可清除蟲體存活[3-4]。與PQS感染小鼠比較，PQR組在感染6d時未出現類似典型的腦型瘧癥狀及體征，其組織病理檢查結果顯示腦組織的炎性反應、pRBC浸潤及組織損傷程度明顯輕于PQS組，腎組織亦顯示相似的組織病理變化趨勢，肝、脾組織在感染6d時鏡下觀察在pRBC及HZ的浸潤方面明顯不同，PQS組pRBC及HZ清晰可見，大量存在，而PQR組鏡下僅見個別pRBC；在組織的炎性反應方面兩組均增強，無明顯差異，炎性細胞的浸潤均以淋巴、單核-巨噬細胞為主。由于PQS組一般只能存活6~9d，故9d后僅對PQR組各組織進行了動態觀察。PQR組9d起炎性反應逐漸增加至17d時達峰值隨之在22d時下降。值得注意的是，兩組小鼠6d時肝、脾組織中炎性細胞增加未見明顯不同，且均以淋巴、單核-巨噬細胞為主，但其感染小鼠原蟲浸潤、病情發展截然不同。大量的研究已經證明：不同類型的淋巴、單核-巨噬細胞等免疫細胞在疾病發展的不同時期發揮著不同的作用[11-12]，擬或抑制及清除原蟲，遏制蟲體血癥，降低炎癥反應，發揮免疫保護作用，亦可發揮促炎功能，誘發免疫病理反應，阻礙機體清除原蟲，使疾病惡化。對于PQS及PQR兩組感染小鼠淋巴、單核-巨噬細胞具體的種類分型有何不同、各自的作用還有待進一步的研究確定。另外，在PQR組各組織中pRBC及HZ的浸潤方面，雖然逐漸增加，在17d時達到峰值，但仍少于PQS組6d時，并在22d時下降減少，這種組織病理學的變化特點與小鼠感染后病情的轉歸及原蟲毒力明顯減弱、致病力下降的抗性表征基本一致[2]。瘧原蟲感染導致死亡的主要原因是腦型瘧并發多器官功能障礙綜合征[7]，腦型瘧的發病機制與機械阻塞及免疫病理相關，瘧原蟲感染并在腦部粘附，誘導宿主抗感染的免疫細胞遷移至腦部并被激活，免疫細胞又促進原蟲在腦部粘附，最終使宿主腦部受到機械和免疫病理雙重損傷而發生腦型瘧[13]，聚集到腦部的pRBC數量及原蟲的侵襲力是腦型瘧發生的關鍵因素。實驗顯示：PQS組腦組織內可見明顯的pRBC及HZ浸潤，小血管內pRBC及紅細胞聚集，并可見與血管內皮細胞粘附；PQR組則在6d時無明顯改變，直至22d腦組織中原蟲始終很少。PQS與PQR兩組在感染相同宿主后的不同轉歸，即死亡與存活時間的不同，從腦組織病理特征的差異亦得到了證明。HZ是瘧原蟲消化血紅蛋白后形成的一種高鐵血紅素聚合物，HZ的形成對于瘧原蟲來說是一種將有毒的游離血紅素進行解毒的過程[14]，HZ與瘧原蟲的毒力有關，其含量與疾病的嚴重程度相關，腦型瘧及病情較重者.含量明顯高于病情較輕者[15]。實驗結果顯示：各組織切片中PQR組的HZ明顯少于PQS組，以往的末梢血片鏡檢亦證實PQR株原蟲中HZ的形成減少或消失[2-3]，這些為PbANKAPQR系毒力及致病力降低提供了佐證，但有關瘧原蟲抗性與HZ的相關性及其機制還有待深入研究。PbANKAPQR系鼠瘧模型的組織病理改變與PQS系相比有明顯差別，該研究結果為瘧原蟲的抗性機制的闡明提供了組織學實驗依據，然而瘧原蟲的抗性機制是十分復雜的課題，還需結合感染免疫調節機制等進行深入研究。

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作者：黃憲希 周利民 沈笑 易國輝 薛偉玲 郭虹 單位：海南醫學院科學實驗中心