豬非典型瘟病毒感染診斷研究范文
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摘要：2017年8月四川省某規模化豬場出現臨產母豬產弱子、發抖、死胎，且死胎率達30％，哺乳仔豬成活率明顯降低，其中以全身性或局部性陣發痙攣為典型癥狀。用RT－PCR擴增及序列分析確診該豬場感染了一種新型的豬非典型瘟病毒（APPV）。這是四川省首次檢測到并報道APPV，可為該病的研究和防控提供了一定的參考。
關鍵詞：陣發痙攣；豬非典型瘟病毒；診斷
豬非典型瘟病毒（Atypicalporcinepestivirus，APPV）是近年來新發現的一種新型瘟病毒［1］，與豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）、邊界病毒（Borderdiseasevirus，BDV）等同屬瘟病毒屬（Pestivirus）黃病毒科（Flaviviridae）［2］。豬群感染該病毒后可引起新生仔豬的先天性震顫癥A－Ⅱ型（CT；myocloniacongenita），俗稱“仔豬抖動病”，其特征是在出生后數小時內可觀察到骨骼肌的雙側痙攣收縮，并造成無法吮乳的現象，嚴重時可損傷仔豬的腦和脊髓，給養豬業造成巨大的經濟損失［3－4］。該病呈廣泛的地理分布，病毒檢出率也在日趨上升，自2015年在美國報道該病毒以來，又逐漸在德國、荷蘭、西班牙、奧地利和中國等地相繼被報道［1，5－9］。近年來，APPV已經引起越來越多的學者的關注［1，5－9］。2017年，該病在國內外的報道中被指出能夠造成規模化豬場哺乳仔豬80％的發病率以及30％～60％的病死率［9－10］。經遺傳進化分析表明APPV復雜多樣，不同地區的分離株具有高度可變性［9］。本試驗中對該豬場的患病豬及死亡豬進行臨床診斷和實驗室確診，最終確診為APPV感染。這也是首次證明了四川規模化豬場存在APPV感染。
1材料與方法
1．1材料
1．1．1病料來源采集四川省某規模化發病豬場的新鮮死胎、弱仔。
1．1．2主要試劑與儀器Trizol試劑盒（RNAisoPlus），上海英駿生物科技有限公司產品；DEPC、酚、SDS試劑，Sigma公司產品；三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇等試劑，成都科龍化工公司產品；PKA酶，默克集團產品；QuickTaqHSDyeMix，東洋紡生物科技有限公司產品；MarkerⅡ、PrimeScriptTMRT試劑盒，大連寶生物公司產品；PCR產物純化試劑盒，北京鴻躍創新有限公司產品；感受態細胞EscherichiacoliDH5α，北京天根生化科技有限公司產品；LB培養基，青島海博試劑有限公司產品；高速離心機5804，Eppendorf公司產品；普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統VersaDoc2000，Bio－Rad公司產品。1．1．3引物參照文獻［8，11］中瘟病毒（Panpesti－virus，PP）通用引物序列，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiverespirato－rysyndrome，PRRSV）、豬圓環病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV－2）和豬偽狂犬病病毒（Pseu－dorabiesvirus，PRV）的特異性檢測引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。
1．2方法
1．2．1核酸的提取取心、脾、肺、腎、腦、淋巴結等組織器官并將其剪碎，同時取適量全血，所有樣本都一式兩份，分別根據RNA和DNA的提取方法進行操作。提取的DNA和RNA置于－80℃保存備用。利用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA反轉錄成cDNA并置于－20℃待用。
1．2．2PCR檢測對提取的DNA和反轉錄后的cDNA模板，進行PCR擴增反應。取擴增產物經20g／L的瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進行檢測。
1．2．3PCR產物的純化、克隆以及轉化對檢測呈陽性的PCR產物按照PCR純化試劑盒說明書進行操作純化目的條帶，并按照pMD19－T載體說明書進行加樣，酶連體系如下：4．5μL回收產物，0．5μLpMD－19Tvector，5μLSolutionI，16℃，連接10h～12h。將上述的連接產物按照感受態細胞E．coliDH5α操作說明書進行轉化，將菌液涂布在加了氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養。
1．2．4菌落PCR鑒定以及測序在37℃培養箱過夜培養的平板上隨機挑取單菌落置于10μL的無菌水中，并取2μL作為模板做菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性的菌液加入含氨芐青霉素的LB液體培養基中，搖菌10～12h后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。
1．2．5相似性及進化樹分析將測序結果在NCBI上進行BLAST比對后，使用Megalign6．0軟件進行相似性比對以及MEGA7的鄰近法（Neighbor－joining）構建系統進化樹，并通過自舉分析（Boot－strap）作置信度檢測，自舉數據集為1000次。
2結果
2．1發病情況、臨床癥狀和病理剖檢
2017年3月以來，四川某規模化豬場，母豬陸續出現產死胎、木乃伊胎，死胎、木乃伊率達16％。隨后發現部分母豬整窩出現初生仔豬全身不自主地抖動，頭部搖擺，后肢無力，不能站立，行動遲緩，無法進行吸吮乳汁，但未見癱瘓癥狀，部分豬只逐漸出現死亡，個別豬只在2周～3周后可康復但同時也表現為預后不良。母豬發病率約為20％，不同窩內發病率為20％～100％，發病母豬各種胎齡均有發生。對消瘦的病死仔豬進行解剖，發現其腦血管周圍、腦部、肺臟有出血，脾臟局部壞死灶和邊緣梗死的情況（圖1）；其他組織器官無明顯病理變化。
2．2PCR檢測
提取所采集的心、脾、肺、腎、腦、淋巴結等組織和全血的DNA和RNA，用PCR方法對CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病原進行檢測，結果均為陰性；再使用瘟病毒屬通用引物對以上cDNA進行PCR擴增，并對PCR產物進行電泳檢測，擴增片段約為800bp，與預期的818bp相一致（圖2）。
2．3序列分析
將克隆轉化后測序得到的序列在NCBI上進行BLAST序列比對，結果顯示是APPV毒株（Atypicalporcinepestivirus）。用Magalign6．0分子生物學軟件將測序得到的基因序列和GenBank上已經發表的參考序列進行序列同源性比對。結果顯示該病毒的核苷酸序列與其他APPV參考株的核苷酸及氨基酸同源性分別為84．8％～92．1％和95．9％～98．1％，與其同源性最高的是德國株LT594521．1。
2．4系統進化樹分析
為了進一步確定該病毒與國內外已發表的參考毒株之間的遺傳進化關系，運用MEGA7生物學軟件的鄰近法構建其系統進化樹狀圖，結果如圖3所示。從核苷酸系統進化樹中可以看出，瘟病毒目前可分為兩大分支，APPV為一大分支，其他瘟病毒為另外一大支，該病毒與CSFV、BVDV、BDV同屬瘟病毒屬，但與APPV親緣關系較近且單獨聚為一支。本研究鑒定的APPV與德國毒株KU041639．1、澳大利亞毒株KX778724．1以及中國毒株（KY624591．1、KX950762．1、KX950761．1、KY612413．1）的序列親緣關系較近，但單獨聚為一支，說明本研究鑒定的APPV可能是一株新的毒株。
3討論
在過去的十幾年中，越來越多的新型瘟病毒已在國內外被發現［4－10］，在美國，德國，荷蘭和奧地利等許多國家已被鑒定。2013年，在澳大利亞的數個豬場的新生仔豬群中暴發了重復性肌陣攣（“顫動仔豬”）［12－18］，大量仔豬可見營養失調，尤其是這種震顫綜合征的并發癥。由于此病暴發，仔豬總體死亡率增加，且每頭母豬的斷奶仔豬數降低了超過10％。2015年，通過宏基因組測序首次在美國的豬群中發現并確定一種與CT型A－Ⅱ相關的新型瘟病毒［2，16］。該病毒可以在患病仔豬的不同組織、體液和中樞神經系統中檢測到，并且在APPV呈陽性的母豬和先天性震顫感染的仔豬的血清中檢測到AP－PV特定抗體，同時對感染仔豬的中樞神經系統進行組織學檢查發現小腦和脊髓的白質出現中度的髓鞘形成減少［9］。在本試驗中，通過RT－PCR方法在哺乳仔豬中檢測到APPV，這是四川省首次檢測到并報道該病毒。本研究中患病豬的臨床癥狀為APPV典型癥狀全身性或局部性陣發痙攣。首先利用PCR方法排除了CSFV、PRRSV、PCV－2和PRV等病毒的感染。運用瘟病毒通用引物對樣本進行RT－PCR擴增，電泳結果顯示擴增片段與預期目的條帶818bp相近，經過序列分析比對，說明該毒株是一株AP－PV。通過克隆測序，本研究鑒定的病毒與其他AP－PV參考株的核苷酸及氨基酸同源性分別為84．8％～92．1％和95．9％～98．1％；從目前的研究來看，與中國廣州毒株PPV1（KY652092）和GD2（KX950762）同源性相對較低，分別為91．4％和84．8％。系統進化樹構建和同源性分析表明，中國發現的APPV毒株存在地域差異性。遺傳進化結果表明本研究鑒定的APPV可能是一種新的毒株。本研究首次在四川地區規模化豬場確定APPV的感染，且有與國內APPV毒株具有明顯的遺傳差異，我們將進一步對該病毒的分子特征和致病機制進行探究。由于該病目前也沒有預防用生物制品，建議該豬場應加強豬場管理，嚴格執行檢疫制度，堅持自繁自養，減少健康豬同病豬之間直接或間接的接觸。嚴禁從有疫病的國家和地區引進種豬、豬精液與胚胎和血液制品，從非疫區引進的種豬要嚴格檢疫。引進種豬到豬場后應嚴格隔離觀察8周以上。同時加強豬舍消毒，實行全進全出制度。使用優質疫苗對豬群進行免疫，提高防疫效果。
作者：周可磊 陳新諾 岳華 張斌 單位：西南民族大學生命科學與技術學院