宮頸癌細胞惡性生物學行為抑制作用范文

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［摘要］

目的研究馬齒莧多糖對宮頸癌細胞惡性生物學行為的抑制作用。方法選擇c57小鼠并建立宮頸癌荷瘤鼠模型，隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組4組，分別接受等滲鹽水、100、200、400mg/kg馬齒莧多糖腹腔注射。治療后檢測移植瘤的體積、重量以及移植瘤中細胞凋亡數目、ATP含量、新生血管分子的表達量。結果低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤體體積和重量、移植瘤組織中的ATP含量以及血管內皮生長因子(VEGF)、CD13、CD34的表達量均低于對照組，凋亡細胞數目多于對照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低移植瘤的體積、重量以及移植瘤中細胞凋亡數目、ATP含量、新生血管血管分子的表達量，增加凋亡細胞的數目。結論馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長、誘導癌細胞凋亡、干擾氧化供能、減少新生血管數目，對宮頸癌細胞惡性生物學行為具有抑制作用。

［關鍵詞］

宮頸癌;馬齒莧多糖;凋亡;血管新生;三磷酸腺苷

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，HPV感染是宮頸癌及癌前病變的重要危險因素［1-2］。近年來，HPV感染率和宮頸癌的發病率呈上升趨勢［3］。手術切除聯合術后放化療的綜合治療方式是臨床治療宮頸癌的主要方式，能夠有效清除病灶并殺滅殘留癌細胞，進而最大限度地預防腫瘤復發。化療是術后綜合治療的重要組成部分，能夠殺滅癌細胞，同時也會損傷正常組織，增加化療藥物劑量雖然能夠增強對癌細胞的殺傷效應、但也會引起機體無法耐受的化療損傷并影響化療效果。近年來，天然植物中多糖成分的抗腫瘤活性受到了越來越多的重視，馬齒莧多糖作為生物反應調節劑亦具有殺滅癌細胞的作用［4］。在本研究中，我們探討了馬齒莧多糖對宮頸癌細胞惡性生物學行為的抑制作用。

1材料與方法

1．1實驗材料c57小鼠32只由浙江大學實驗動物中心提供［實驗動物許可證號:SCXK(滬)2015-0107］，均為雌性、周齡4～6周、體重18～25g。馬齒莧多糖由浙江省立同德醫院藥劑科提取和分離，TUNEL試劑盒購自Roche公司，ATP檢測試劑盒和蛋白濃度BCA測定試劑盒購自碧云天公司，血管內皮生長因子(VEGF)、CD13、CD34以及β-actin單克隆抗體購自Abcam公司;熒光顯微鏡為Nikon公司產品，電化學顯影儀為天能公司產品。

1．2實驗方法

1．2．1宮頸癌荷瘤鼠模型的制作方法取SiHa細胞株(購自中科院上海分院)，常規復蘇、培養、傳代后得到對數期生長細胞，用培養基將細胞濃度稀釋至1×107/ml，取細胞懸液100μL注射入小鼠背部的皮下組織。待腫瘤生長、瘤體形成后，用影像學檢查測定瘤體體積，篩選瘤體直徑1．2～1．6cm的小鼠作為宮頸癌荷瘤鼠模型。

1．2．2動物分組及藥物治療方法宮頸癌荷瘤鼠模型制作成功后，將模型小鼠隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組4組，每組8只，分別接受等滲鹽水、100、200、400mg/kg馬齒莧多糖腹腔注射，每日給藥1次，連續治療12d。

1．2．3瘤體體積及重量處死小鼠后，分離皮下腫瘤組織，測定瘤體的體積和重量。

1．2．4瘤體內細胞凋亡情況取移植瘤組織充分研磨，用TUNEL試劑盒檢測瘤體內細胞凋亡情況，分別用TUNEL試劑和DAPI試劑對凋亡細胞以及細胞核染色，然后在熒光顯微鏡下觀察4～6個隨機視野內的200個細胞，計算凋亡細胞的數目。

1．2．5腫瘤組織ATP生成能量取移植瘤組織充分研磨，參照試劑盒說明書檢測ATP含量。同時，用BCA試劑盒計算待測樣本中的蛋白總含量，以總蛋白含量為內參照計算每mg蛋白內ATP的含量。

1．2．6免疫印跡檢測取移植瘤標本，加入RIPA蛋白裂解液后勻漿、離心后取上層蛋白樣本，加入上樣緩沖液后于100℃高溫變性10min。取變性后的蛋白標本適量，加入預先配置好的SDS-PAGE凝膠中，依次進行垂直電泳、電轉膜、抗原位點封閉、第一抗體孵育、第二抗體孵育以及電化學發光(electrochemilu-minescence，ECL)顯影。孵育的抗體包括VEGF、CD13、CD34以及β-actin。得到蛋白條帶后計算灰度值，以β-actin為內參照對蛋白含量進行半定量分析。

1．3統計學處理采用SPSS21．0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(x珋±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。定性資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1瘤體體積及重量低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤體體積及重量均低于對照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性方式降低瘤體體積及重量，高劑量組的瘤體體積及重量均低于低劑量組、中劑量組，中劑量組的瘤體體積及重量均于低劑量組。見表1(P均＜0．05)。

2．2瘤體內凋亡細胞數目低、中和高劑量組腫瘤組織中的瘤體內凋亡細胞數目均高于對照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式增加瘤體內凋亡細胞數目，高劑量組腫瘤組織中的瘤體內凋亡細胞數目均高于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的瘤體內凋亡細胞數目均高于低劑量組。見表2。

2．3血管新生分子的蛋白含量低劑量組、中劑量組和高劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于對照組，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34蛋白含量，高劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量均于低劑量組。見表3。

2．4ATP含量低劑量組、中劑量組和高劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于對照組，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中的ATP含量，高劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于低劑量組。見表4。

3討論

化療是宮頸癌綜合治療方案的重要組成部分，化療藥物的毒副作用較強，雖然能夠有效殺傷腫瘤細胞，但也會對正常組織造成較為嚴重的損傷。在臨床實踐中，使用化療藥物治療宮頸癌時，提高化療藥物劑量、增加不同作用機制的化療藥物種類能夠增強化療藥物對癌細胞的殺傷效應，但同時也加重正常組織的損傷，若患者無法耐受，會影響化療效果［5］。近年來，許多研究報道從多種植物中提取的多糖類物質具有抗腫瘤活性。植物多糖一般不通過直接殺傷腫瘤細胞來發揮抗腫瘤效應，而是作為生物反應調節劑來增強體內的免疫應答和凋亡途徑、氧化呼吸功能途徑等來殺傷癌細胞［6］。因此，植物多糖對正常組織的損傷較小，篩選具有宮頸癌細胞殺傷效應的植物多糖并與常規化療藥物聯合應用能夠改善宮頸癌的治療效果。

馬齒莧是我國資源儲備極為豐富的一類藥食兩用植物，其主要功效為清熱解毒、涼血消腫，對于腹瀉、痢疾、感染等疾病具有治療作用［7］。馬齒莧所包含的有效化學成分包括多糖、黃酮類、萜類、生物堿以及香豆素類等。該植物的粗提物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種活性，進一步的分離純化發現，馬齒莧中的多糖成分具有抗腫瘤效應。趙蕊等［8-9］的研究顯示，馬齒莧多糖能夠增強宮頸癌荷瘤鼠的免疫功能、降低腫瘤細胞發生免疫逃逸的風險，進而使荷瘤鼠的腫瘤體積明顯縮小。該研究提示馬齒莧多糖具有抗腫瘤活性，能夠有效抑制宮頸癌移植瘤的生長。

目前關于馬齒莧多糖抗腫瘤效應的研究報道較少，為了進一步明確馬齒莧多糖對宮頸癌的殺傷和抑制效應及生物學機制，我們建立了宮頸癌荷瘤鼠模型，通過腹腔注射不同濃度馬齒莧多糖進行治療。我們對移植瘤的生長情況進行了初步分析，對腫瘤體積的測量結果可知，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低瘤體體積及重量，馬齒莧多糖的濃度越高，瘤體的體積和重量越低。這部分結果與趙蕊等［8-9］的研究結果相吻合，說明馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長。在得到馬齒莧多糖抑制腫瘤生長的結果后，我們進一步分析了腫瘤組織中癌細胞相關的惡性生物學行為。在宮頸癌的發生和發生過程中，宮頸上皮的表型發生變化，多種抑癌基因失活、原癌基因激活、細胞周期蛋白和抗凋亡分子表達增加會使得宮頸上皮由正常表型向惡性增殖表型轉化，表現為極強的增殖能力和抗凋亡能力［10］。化療藥物和植物多糖發揮抗腫瘤效應的根本途徑就是通過不同機制來誘導癌細胞發生凋亡［11］。本研究發現，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式增加瘤體內凋亡細胞數目。說明馬齒莧多糖能夠誘導宮頸癌移植瘤組織中的癌細胞發生凋亡。

無限增殖是癌細胞基本的惡性生物學特征，細胞表型的轉變是癌細胞增殖的首要步驟，而后需要局部新生血管提供的營養物質來進行氧化供能［12］。細胞增殖是耗能的主動過程，線粒體氧化呼吸過程能夠為該過程提供所需的ATP，而局部新生血管形成則能為氧化呼吸過程提供必須的氧氣等原材料［13］。VEGF是促血管新生效應最強的細胞因子、能夠反映腫瘤組織血管生成的能力。CD13和CD34是內皮細胞的標志分子，能夠反映腫瘤組織中血管生成的數目［14］。結果顯示，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中VEGF、CD13和CD34表達量以及ATP含量。綜上所述，馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長、誘導癌細胞凋亡、干擾氧化供能、減少新生血管數目，對宮頸癌細胞惡性生物學行為具有一定的抑制作用。

作者：丁虹 唐雯靜 龐燕芬 呂雯 單位：南京軍區杭州療養院海勤療養區婦科 浙江省立同德醫院婦產科