乳鼠移植瘤癌細(xì)胞論文范文

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1材料與方法

1．1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的PC3細(xì)胞，迅速放入預(yù)熱的37℃水浴鍋中，快速震蕩溶化，1000r•min－1離心5min后，將細(xì)胞接種于已配制好的含10％FBS和1％L－Gln的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．每隔2～3d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待其長到鋪滿皿底80％時傳代．依據(jù)Friedenstein［11］提出的全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離和純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）做為陰性對照組細(xì)胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)．

1．2軟瓊脂克隆

1．2．1軟瓊脂儲備膠的制備下層膠制備：配制1．2％的低熔點瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37℃左右后置于37℃水浴鍋備用．取1．5mL1．2％低熔點瓊脂糖加入已經(jīng)配好的1．5mL2×DMEM培養(yǎng)基（含20％FBS＋1％Gln），混勻后倒入六孔板中制成軟瓊脂底板，置于冰袋上待其冷卻凝固后備用．上層膠制備：配制0．7％的低熔點瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37℃左右后置于37℃水浴鍋備用，取1．5mL0．7％低熔點瓊脂糖加入已經(jīng)配好的約含有1～3×103mL－1PC3細(xì)胞的等體積2×DMEM培養(yǎng)基中，混勻后倒入軟瓊脂底層上，制成雙瓊脂層，置于冰袋上待其冷卻凝固后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14d左右鏡檢，觀察軟瓊脂克隆團(tuán)的形成情況．

1．2．2單細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)的獲取軟瓊脂克隆團(tuán)形成第14d置于倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)記并挑出較大克隆團(tuán)后置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)．第3d觀察有無貼壁細(xì)胞生長，若有則棄去含有瓊脂渣的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2～3d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿皿底80％～90％時傳代；若無貼壁細(xì)胞生長則棄去培養(yǎng)皿，重新挑取單克隆團(tuán)細(xì)胞．

1．3乳鼠移植瘤動物模型的構(gòu)建取對數(shù)生長期的實驗組細(xì)胞PC3和對照組細(xì)胞BMSCs，經(jīng)胰蛋白酶消化后，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1000r•min－1離心7min，棄上清，DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×107mL－1．用1mL注射器吸取0．1mLPC3細(xì)胞懸液接種于實驗組乳鼠皮下，對照組乳鼠皮下注射0．1mLBMSCs細(xì)胞懸液．注射后每天定時觀察乳鼠皮下的成瘤情況，用游標(biāo)卡尺測量皮下腫物的直徑，以大于0．5cm為成瘤成功．

1．4病理組織觀察和免疫組織化學(xué)檢測剝離乳鼠皮下產(chǎn)生的腫物，9％福爾馬林液固定，組織過夜脫水后，石蠟包埋切片．切片組織經(jīng)過二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，蘇木精染色3～5min，1％HCl分色1～3s，碳酸鋰返藍(lán)2min，伊紅染色2min，酒精脫水，干燥后中性樹脂封片．在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理切片形態(tài)．免疫組織化學(xué)染色按照免疫組化二抗試劑盒說明書操作：石蠟切片烘烤30min后，二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)5min，PBS沖洗3×3min，3％去離子水孵育15min，PBS沖洗3×3min，滴加試劑A（山羊血清）室溫孵育15min，傾去勿洗，滴加一抗（陰性對照組一抗用PBS代替），37℃孵育2h，PBS沖洗3×3min，滴加試劑B室溫孵育15min，PBS沖洗3×3min，滴加試劑C室溫孵育15min，PBS沖洗3×3min，DAB顯色，自來水沖洗，干燥，中性樹脂封片．光學(xué)顯微鏡下觀察抗體表達(dá)部位．

2結(jié)果與分析

2．1PC3軟瓊脂克隆團(tuán)產(chǎn)生和單細(xì)胞克隆團(tuán)形成PC3接種第7d時軟瓊脂上產(chǎn)生了較小的細(xì)胞克隆團(tuán)（圖1：A），待其長到13d時，形成較大的細(xì)胞克隆團(tuán)（圖1：B）．選取較大克隆團(tuán)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)（圖1：C，D）后發(fā)現(xiàn)，這部分從軟瓊脂克隆團(tuán)上挑出的單細(xì)胞比未經(jīng)軟瓊脂克隆的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。

2．2乳鼠皮下成瘤18只實驗組乳鼠皮下均有直徑大于0．5cm的腫物產(chǎn)生，6只對照組乳鼠皮下均無異物產(chǎn)生且生長狀態(tài)良好．肉眼觀察實驗組乳鼠發(fā)現(xiàn)：注射第2d后乳鼠腋下發(fā)紅腫脹，觸摸質(zhì)軟；第3～4d乳鼠腋下發(fā)紅完全消失，腫脹部分逐漸變硬，觸摸可發(fā)現(xiàn)有黃豆粒大小可移動腫物存在（圖2：A）．第7d乳鼠皮下腫物逐漸增大，觸摸質(zhì)硬（圖2：B）．第16d之后，部分乳鼠維持腫物大小不變，部分乳鼠腫物開始消退（圖2：C）．第21d之后，除3只乳鼠皮下存在極小腫物外（圖2：D），其余乳鼠腫物均消退．表明在初接種PC3細(xì)胞時乳鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，腫瘤細(xì)胞能夠被宿主的免疫系統(tǒng)接受并逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)控即具有免疫耐受性，使腫瘤在皮下發(fā)生并生長．接種16d及之后，有部分乳鼠皮下腫物開始消退，提示此時接種鼠的免疫系統(tǒng)已逐漸發(fā)育完全，能夠?qū)臃N的異質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫監(jiān)控和殺滅．接種21d后，只有3只鼠皮下存在腫瘤，類似于部分腫瘤存在于人類非免疫缺陷人群中，其余鼠消退證明此時小鼠免疫功能已發(fā)育完全．

2．3病理組織變化和CD133表達(dá)觀察病理組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫物組織內(nèi)有大片彌漫性分布、紊亂無章排列的腫瘤細(xì)胞存在，細(xì)胞形態(tài)大小不一，核大深染，可見明顯病理性不規(guī)則核分裂相，為中度不典型增生，病理學(xué)上診斷為腫瘤組織（圖3：A）．免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示該腫瘤組織表達(dá)了前列腺癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物分子CD133細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均呈陽性（＋＋）（圖3：B）．

3討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個非常復(fù)雜的過程，在生物體內(nèi)直接研究癌細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)理和細(xì)胞生物學(xué)特性受到很多因素的影響．因此，建立理想動物移植瘤模型對各種基礎(chǔ)研究和臨床研究都有非常重要的意義，但要求該模型的腫瘤發(fā)生部位、發(fā)病機(jī)制以及生物學(xué)特性等方面均要符合所研究的人源腫瘤．可移植腫瘤動物模型具有接種腫瘤細(xì)胞后實驗動物帶有同一腫瘤，個體差異較小、生長狀況和宿主反應(yīng)一致，可以較為客觀的判斷腫瘤治療的療效等特點，在目前腫瘤模型研究中應(yīng)用較為廣泛．腫瘤動物模型的移植主要有兩種［12］：同種移植和異種移植；同種移植是指模型動物間的移植，而異種移植是指任何人和裸鼠之間的移植．一般的鼠移植性實驗?zāi)[瘤為自發(fā)性或者誘發(fā)性腫瘤，這部分腫瘤經(jīng)傳代后可保持其原有特性，從而成為移植性腫瘤．軟瓊脂克隆形成實驗（Softagarassay）是體外研究腫瘤的一項重要實驗，常用來檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞［13］．Li等人的研究發(fā)現(xiàn)［14］：通過軟瓊脂克隆形成實驗篩選出的腫瘤細(xì)胞在動物成瘤實驗中具有強(qiáng)的成瘤和轉(zhuǎn)移能力，并且具有腫瘤干細(xì)胞特性［15］．因此本實驗利用目前研究較為成熟的前列腺癌細(xì)胞PC3中存在極少部分具有致瘤性的CD133＋前列腺癌干細(xì)胞［16－18］做為模型動物的接種細(xì)胞系，通過軟瓊脂克隆形成實驗篩選出此類細(xì)胞中具有強(qiáng)克隆集落形成能力和增殖能力的腫瘤細(xì)胞接種于乳鼠皮下，提高致瘤成功率．實驗結(jié)果顯示：接種PC3細(xì)胞乳鼠成瘤率為100％，在接種2～15d移植瘤穩(wěn)定而快速增長，移植瘤經(jīng)剝離后病理切片HE染色觀察有大片彌漫性分布的癌細(xì)胞，且有典型的病理學(xué)不規(guī)則核分裂相存在，病理學(xué)上診斷為腫瘤組織，免疫組織化學(xué)染色后前列腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133表達(dá)水平呈強(qiáng)陽性，表明本實驗成功建立了乳鼠移植瘤模型．綜上所述，本實驗利用出生2d乳鼠成功構(gòu)建了動物移植瘤模型，由于剛出生乳鼠的免疫細(xì)胞在個體發(fā)育的早期對抗原易形成耐受性，因此易于移植瘤的成活和生長，同時正常的免疫機(jī)體環(huán)境也模擬了臨床上腫瘤發(fā)生的微環(huán)境．此外，乳鼠移植瘤模型能夠體現(xiàn)宿主免疫監(jiān)控移植瘤這一過程，模擬臨床腫瘤發(fā)生．且這一模型具有成瘤率高、易于存活、生長條件簡單等特點，是一種比較理想的移植瘤動物模型。

作者：曾家豫張虹袁紅霞牛童廖世奇單位：西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院分子生物中心