論小兒消食片遺傳毒性評價范文

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摘要:目的對小兒消食片遺傳毒性進行評價。方法通過中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，進行小兒消食片遺傳毒性研究。結果3個試驗結果均判定為陰性。結論在本試驗條件下，小兒消食片未發現潛在的遺傳毒性，安全性良好。

關鍵詞:小兒消食片;遺傳毒性;中國倉鼠

肺細胞體外染色體畸變試驗;小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗;鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗小兒消食片是《中國藥典》收錄品種，有消食化滯、健脾和胃的功效，用于食滯腸胃所致積滯，癥見食少、便秘、脘腹脹滿、面黃肌瘦等癥［1］，由山楂、炒麥芽、六神曲(炒)、炒雞內金、檳榔、陳皮組成，均是經典的兒科消食化積類藥材。其中，檳榔為佐藥，歸脾、胃、大腸經［2］，功效行氣健脾，檳榔堿是其主要有效成分［3］，有擬膽堿作用，可用于驅蟲、神經系統［4］、心血管系統［5］、消化系統［6］、內分泌系統等方面［7］，但也有研究表明，該成分具有一定生殖毒性［8］、基因毒性［9］，而且存在劑量相關性［10］。雖然檢索目前國內外醫學文獻均未發現含檳榔制劑致癌病例的報告，但不能排除檳榔入藥有致突變、致癌的毒性［11］。遺傳毒性評價是藥物非臨床安全性評價的重要內容，在預測化合物的潛在致癌性和可遺傳突變方面具有重要應用價值。本實驗根據藥物遺傳毒性研究技術指導原則規定［12］，采用經典的中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，對小兒消食片遺傳毒性進行評價，以期為該制劑在臨床合理用藥及安全風險方面的研究提供實驗依據。

1材料

1.1試藥小兒消食片(批號1601016)，0.3g/片，由山東宏濟堂制藥集團股份有限公司提供。所用試劑均為分析純。

1.2細胞、動物及菌株中國倉鼠肺細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，經檢測無支原體感染。昆明種小鼠，SPF級，體質量25～30g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001，實驗動物使用許可證號SYXK(魯)2014-0008。組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535購自美國Moltox公司，經生物學鑒定符合試驗要求。

1.3儀器E100生物顯微鏡(日本尼康公司);LMQ．C立式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司);YLN-50A菌落計數器(北京譽朗諾科技有限公司);HFsafe-1500TE生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)。

2方法［12-16］

2.1中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗通過細胞毒性試驗結果、細胞半數生長抑制濃度(6、24、48h內IC50分別為4.545、3.695、2.272mg/mL)設定染色體畸變試驗劑量，同時設陽性對照組(注射用絲裂霉素、注射用環磷酰胺)和陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)。取生長良好的中國倉鼠肺細胞，調整密度為1×105/mL，接種于25cm2細胞培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱內過夜培養24h。吸取培養液，加小兒消食片溶液，直接法分為6、24、48h作用組(代謝活化法為6h作用組)，其中6h作用組終質量濃度分別為5.0、2.5、1.25mg/mL，24h作用組分別為4.0、2.0、1.0mg/mL，48h作用組分別為2.5、1.25、0.625mg/mL。陽性對照組6h作用組采用0.15μg/mL注射用絲裂霉素［哺乳動物肝微粒體酶制劑(無S9)］和10μg/mL注射用環磷酰胺(有S9)，24、48h作用組采用0.05μg/mL注射用絲裂霉素;陰性對照組均采用0.9%氯化鈉注射液。各組于終止培養收獲前3～4h加入終質量濃度為0.4μg/mL的秋水仙素溶液，使染色體停滯于分裂中期，收集細胞，制片、染色后顯微鏡檢驗，選擇分散較好的200個中期分裂相細胞，記錄染色體形態變化，計算各組染色體結構畸變細胞的比例。

2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗根據藥物遺傳毒性研究技術指導原則，若供試品LD50大于5000mg/(kg·d)時，可取5000mg/(kg·d)作為最高劑量。取體質量25～29g的雄性小鼠72只，隨機分為小兒消食片低、中、高劑量和最大溶解度組(1250、2500、5000mg/kg)，陰性對照組(純化水)，陽性對照組(50mg/kg注射用環磷酰胺溶液)，每組12只，給藥后于26～28、46～48h采樣，結果以各劑量組的嗜多染細胞微核率(MNPCE)表示。觀察200個嗜多染紅細胞(PCE)，同時記錄觀察正染紅細胞(NCE)數，計算PCE/(NCE+PCE)，并規定給藥組PCE/(NCE+PCE)不應低于對照組的20%。

2.3鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗通過平皿摻入法，選擇組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，分別采用直接法、代謝活化法。預試驗結果表明，不加S9代謝活化系統時，小兒消食片各劑量組對TA98、TA100無顯著抑菌作用，回變菌落數與陰性對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，故正式試驗中最高劑量設為5000μg/皿。每一菌株設5個劑量組，每組3個平皿，質量濃度分別為5000、2500、1250、625、312.5μg/皿，同時設陰性對照組(滅菌注射用水)和陽性對照組(不加S9混合液時，TA97a、TA98用2，4，7-三硝基-9-芴酮，劑量為0.2μg/皿，或用4-硝基喹啉-N-氧化物，劑量為0.5μg/皿;TA100、TA1535用疊氮鈉，劑量為1.5μg/皿;TA102用注射用絲裂霉素，劑量為0.5μg/皿。加S9混合液時，TA97a、TA98、TA100用2-氨基芴，劑量為50μg/皿;TA102用1，8-二羥基蒽醌，劑量為50μg/皿;TA1535用注射用環磷酰胺，劑量為200μg/皿)。平皿置于37℃生化培養箱內培養，48h后觀察計數。

2.4統計學分析通過DAS1.0軟件進行統計學處理，數據以(x±s)表示。P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

3結果

3.1中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗表1顯示，在1.25～5.0mg/mL下作用6h(±S9)，1.0～4.0mg/mL下作用24h，0.625～2.5mg/mL下作用48h時，染色體畸變數均＜5%，而且未呈現劑量反應關系，結果判定為陰性。

3.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗表2顯示，小兒消食片各劑量組給藥后于26、46h采樣時，PCE/(PCE+NCE)與陰性對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，表明對骨髓細胞的造血功能沒有產生抑制作用，同時微核率亦然(P＞0.05)，表明對小鼠骨髓細胞無致微核作用，結果判定為陰性。

3.3鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗表3顯示，在有或無S9活化系統的條件下，陰性對照組中各試驗菌株的回復突變菌落數均在正常范圍內，而陽性對照組顯著更高(P＜0.01);小兒消食片在312.5～5000μg/皿劑量范圍內無明顯抑菌作用，回變菌落數與陰性對照組比較無顯著變化(P＞0.05)，未呈現濃度依賴性增加，表明無誘導鼠傷寒沙門氏菌基因突變作用，結果判定為陰性。

4討論

遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要環節，與致癌性研究、生殖毒性研究均有著密切聯系［12，17］。2006年，人用藥物注冊技術要求國際協調會議(ICH)在修訂了新藥遺傳毒性注冊評價的標準試驗組合［18］。染色體畸變是外源化學物作用于機體或培養細胞后所引起的最常見遺傳物質損傷之一［19］，該試驗目前廣泛應用于考察致突變現象，反映的遺傳學終點是染色體分離、完整性改變［20］，其結果對評價供試品的遺傳毒性具有重要價值［21］微核試驗廣泛用于評價新藥、食品添加劑等對體內細胞或體外培養細胞的遺傳學損傷［22］，是目前最常用的新藥遺傳毒性試驗方法［19，23］，微核率增高可反映染色體損傷的遺傳效應。污染物致突變性檢測快速敏感，已成為初步篩選化學物潛在致突變的首選方法［24］，可從基因水平反映遺傳物質受損情況。本實驗采用遺傳毒性評價標準試驗組合方法，分別從動物水平、染色體水平、基因水平綜合評價小兒消食片遺傳毒性，發現該制劑在本試驗條件下無潛在遺傳毒性，安全性良好。今后，將對小兒消食片中檳榔有效成分檳榔堿的毒性進行深入研究，并制訂其含有量限度，為該制劑臨床應用提供更全面的科學依據。

作者：李海燕1，譚樂俊1，孟兆青1，馬玉奎2*，劉愛明2，高梅2單位：1．山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，2．山東省藥學科學院新藥評價中心