諾如病毒疫情分子的流行病學特征范文

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摘要：目的了解深圳市光明新區諾如病毒疫情暴發的病原體基因分型情況和分子流行病學特征。方法收集2016年12月至2017年3月感染性腹瀉暴發疫情患者的肛拭子標本，通過熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測諾如病毒核酸，陽性標本采用巢式PCR擴增諾如病毒VP1基因區（ORF1－ORF2），PCR擴增產物經瓊脂糖電泳鑒定后進行測序分析。結果9起暴發疫情共檢測標本101份，諾如病毒陽性標本共54份，總陽性率為53．47％，其中GⅡ型標本52份，GⅠ型標本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染標本1份。測序成功獲得48份陽性標本GⅡ型諾如病毒VP1基因序列，47份為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，其中45份與2016年中國香港株（KY771081）和中國廣東株（KY485113）同源性最高，2份與2017年中國江蘇株（KY806301）和2016年泰國清邁株（MF972308）同源性最高；1份為GⅡ．P7／GⅡ．6亞型，與2014年中國臺灣株（KM267741）同源性最高。結論2017年該區諾如病毒疫情暴發的主要型別為GⅡ型，優勢流行株為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型。

關鍵詞：諾如病毒；疫情；流行特征；分子分型

諾如病毒為杯狀病毒屬的單鏈RNA病毒，是引起全球急性腸胃炎最重要的病原體之一［1］。諾如病毒共分為GⅠ～GⅦ7個基因組和30個基因型［2］。自2014年11月起就有報道顯示，在中國廣東、江蘇和浙江，以及日本等亞洲地區均有新型諾如病毒GⅡ．17引起的疫情暴發，對世界公共衛生造成極大的影響［3－7］。從2016年底至今，深圳地區不同區域連續暴發諾如病毒疫情引起了相關衛生部門的重視。本研究對2016年12月至2017年3月光明新區幼兒園和小學因腹瀉的患者進行諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒檢測，檢測陽性標本進一步測序分型，以了解造成疫情的主要病原體和腹瀉病毒的分子特征，以期對深圳地區諾如病毒暴發的流行狀況和疫情防控提供科學依據，現報道如下。

1資料與方法

1．1一般資料

采集2016年12月至2017年3月9起感染性腹瀉疫情患者的肛拭子標本101份。101份標本均來自光明新區幼兒園和小學，主要臨床表現為嘔吐、腹痛、低熱、惡心等。

1．2儀器與試劑

天隆科技全自動核酸提取儀（型號NP968－S），達安基因諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測試劑盒，采用聚合酶鏈反應（PCR）－熒光探針法。

1．3方法

1．3．1標本前處理將肛拭子加入含有3mL標本稀釋液的采樣管中，混勻振蕩，靜置5min后進行病毒核酸檢測。1．3．2病毒RNA提取吸取標本處理液200μL，采用天隆科技全自動核酸提取儀NP968－S提取病毒RNA，具體操作見說明書。1．3．3熒光定量PCR檢測采用達安基因的諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測試劑盒（PCR－熒光探針法）對疫情標本進行核酸快速檢測。1．3．4PCR擴增陽性標本核酸采用2對擴增引物進行諾如病毒VP1基因PCR擴增，擴增片段大小為1000bp，2對PCR引物分別為GⅡPF800M：5′－GAT－GCWGAYTAYTCYMGNTGGGA－3′（4289－4311）；GⅡCR1450：5′－ACCCARGMNTCAAAYCTRAART－3′（6622－6643）；GⅡPF750M：5′－CNGCHHTAGAR－RTNATGGT－3′（4341－4359）；GⅡ－R1M：5′－CCRCC－NGCATRNCCRTTRTACAT－3′（5367－5389）。首次PCR采用引物GⅡPF800M／GⅡCR1450進行擴增，反應體系為25μL，PCR擴增條件為：45℃30min反轉錄，94℃5min預變性，94℃1min，47℃1min，72℃3min，35個循環后72℃7min延伸。首次PCR擴增產物采用引物GⅡPF750M／GⅡ－R1M進行二次巢式PCR擴增，反應體系為25μL，PCR擴增條件為：94℃5min預變性，94℃1min，47℃1min，72℃1．5min，29個循環后72℃7min延伸。2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，大小為1000bp。1．3．5測序分析委托北京六合華大基因科技有限公司對PCR產物進行測序，測得序列結果在BLAST上進行對比尋找同源序列，并在GenBank上尋找參考株毒株。

1．4統計學處理

采用MEGA7．0軟件中的Neighbor－joining方法（N－J法）構建系統進化樹，選擇Bootstrap程序進行1000次重復取樣數目來分析進化樹。

2結果

2．1流行病學調查及實驗室檢測結果

101份肛拭子標本經諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測共獲得陽性標本54份，總陽性率為53．47％，其中GⅡ型標本52份，GⅠ型標本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染標本1份。疫情暴發場所均為幼兒園和小學，高發人群為3～8歲幼年兒童，其次為青少年。暴發季節在冬春兩季。

2．2VP1基因核苷酸系統進化分析

經熒光定量PCR檢測出的54份陽性標本采用2對引物GⅡPF800M／GⅡCR1450和GⅡPF750M／GⅡ－R1M進行諾如病毒VP1基因PCR擴增，PCR產物經序列測定共獲得48條基因序列，其余標本因保存原因或信號弱，測序未成功。成功測序的48份NoV毒株VP1基因核酸序列經比對分析見圖1。在47份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株中，有45份與2016年中國香港株（KY771081）和中國廣東株（KY485113）的核苷酸序列位于系統進化樹上同一分支，同源性較高；2份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）與2017年中國江蘇NoV重組株（KY806301）和2016年泰國清邁NoV重組株（MF972308）核苷酸序列表現出高度同源性（99％），而與2016年中國香港株（KY771081）和中國廣東株（KY485113）序列親緣性較遠，并非同一進化分支上。1份GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB201612120）與2014年中國臺灣株（KM267741）的核苷酸序列位于系統進化樹上同一分支，同源性高達90％以上。與其他45份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型NoV毒株不在同一進化分支上的LB2017030310和LB2017030312NoV毒株卻與GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB2016121260）在同一進化支上。

3討論

諾如病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病因，同時也是引起成人腹瀉的第2病因，每年導致100萬人住院及20萬兒童（＜5歲）死亡。伴隨著輪狀病毒疫苗的研制成功和逐步推廣，諾如病毒有可能成為引起急性非細菌性胃腸炎和食源性疾病的首要病因。近年來，諾如病毒在世界范圍內頻繁暴發，中國的感染率也不斷上升。本研究結果顯示，深圳市光明新區2016年12月至2017年3月暴發的9起諾如病毒疫情流行高峰在冬春季，與往年報道深圳地區諾如病毒感染的暴發季節一致［8］。101份諾如病毒感染性腹瀉病例以光明新區幼兒園和小學3～8歲幼年兒童為主，提示哨點監測應掌控在病毒主要的流行季節，并在相關場所做好相應防護措施。諾如病毒具有豐富的遺傳多樣性，其基因組全長7．5～7．8kb，包括3個開發閱讀框（OORFs）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2區編碼衣殼蛋白VP1，包括S區和P區，P區進一步分為P1、P2區，其中P2區域含有結合受體的關鍵位點和病毒抗原性表位［9］。本研究選擇諾如病毒ORF1－ORF2區為靶基因，采用2對引物進行PCR擴增并進行分型測序。綜合9起暴發疫情測定病例標本VP1全基因序列遺傳進化分析表明，48份陽性標本中47份為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，其中45份與2016年中國香港株（KY771081）和中國廣東株（KY485113）核苷酸同源性最高，2份與2017年中國江蘇NoV重組毒株（KY806301）和2016年泰國清邁NoV重組毒株（MF972308）核苷酸同源性最高；1份為GⅡ．P7／GⅡ．6亞型，與2014年中國臺灣株（KM267741）核苷酸同源性最高。2份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）與1份GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB201612120）在同一進化分支上，提示這2株NoV毒株可能為重組株。基因重組是病毒進化的重要手段，本研究發現，NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）可能是近年來新出現的GⅡ．P16／GⅡ．2亞型重組毒株，需要引起注意。同時，探索VP1區域變異與重組的相關性對于GⅡ．2亞型流行株重組機制的研究有重要意義。近20年研究表明，諾如病毒GⅡ型是引起感染的主要基因組，GⅡ．4亞型則是最流行的基因亞型［10］。本研究結果顯示，深圳市光明新區諾如病毒疫情暴發的主要型別為GⅡ型，優勢流行株為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，并且出現2株可能為GⅡ．2亞型重組株。2016年深圳市諾如病毒主要流行株為GⅡ．2亞型，表明近2年流行株基因型由GⅡ．4亞型轉變為GⅡ．2亞型；同時顯示在光明新區GⅡ．2亞型毒株比其他毒株有更高的侵襲力。從2016年冬季到2017年春季，9起諾如病毒疫情在光明新區呈地區聚集性暴發，而往年并沒有同類情況出現，引起這些聚集性暴發疫情的原因還有待進一步調查研究。本研究初步對深圳市光明新區諾如病毒疫情暴發的病原體基因分型情況和分子流行病學特征進行研究，為今后的預防控制積累了經驗。由于深圳地區人口流動性大，而諾如病毒的基因型較多，每年都有不同的流行株，醫院、學校及食堂等公共場所成為諾如病毒大肆流行的主要聚集地［11－13］。因此，長期對諾如病毒流行情況實施監測很有必要。

參考文獻

［8］楊慧，李靜媚，陳應堅，等．2014年深圳市龍崗區諾如病毒胃腸炎暴發的分子流行病學特征［J］．熱帶醫學雜志，2016，16（9）：1208－1211．

［10］吳微，張宏斌，張海龍，等．2010年深圳地區諾如病毒的基因分型［J］．病毒學報，2012，28（3）：219－223．

［13］吳清平，薛亮，張菊梅．諾如病毒流行株GⅡ．4型進化研究進展［J］．微生物學報，2012，52（12）：1431－1438．

作者：鐘逶迤 姚云英 李燕 姚煒 羅淑華 劉滕穎子 汪東籬 單位：廣東省深圳市光明新區疾病預防控制中心