馬動(dòng)脈炎病毒雙抗體檢測(cè)方法范文

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《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2014年第八期

1材料和方法

1.1病毒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及檢測(cè)抗體的標(biāo)記將EAVBucyrus株接種于RK-13單層細(xì)胞，細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次，2000r/min離心30min，除去細(xì)胞碎片，收取上清液。上清液倍比稀釋后接種于RK-13細(xì)胞，48h初步判定，72h最終判定，測(cè)得病毒上清液的毒價(jià)為10-5.5TCID50/100μL。將病毒上清液與0.5%TritonX-100混合，室溫靜置15min，12000r/min，4℃離心10min，上清液即為病毒標(biāo)準(zhǔn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記的MAb2B3(HRP-2B3)由天津三箭生物技術(shù)公司標(biāo)記，分裝保存于-20℃。

1.2DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.1操作程序利用pH7.6的PBS稀釋純化的MAb2B9包被酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過夜，采用0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min；5%脫脂乳封閉酶標(biāo)板，37℃2h，洗板；加病毒標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照(RK-13細(xì)胞上清液)，100μL/孔，37℃1h，洗板；HRP-2B3孵育酶標(biāo)板，37℃1h，洗板；通過TMB使底物顯色，100μL/孔，37℃10min；最后以2M濃硫酸50μL/孔終止反應(yīng)，測(cè)定OD450nm值。

1.2.2最佳反應(yīng)條件的選擇在不同反應(yīng)條件下，對(duì)捕獲抗體包被量(8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)，抗原的工作濃度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300)，HRP-2B3稀釋度(1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000)，病毒標(biāo)準(zhǔn)品、捕獲抗體、檢測(cè)抗體(0.5h、1h、1.5h、2h)及TMB最佳作用時(shí)間(5min、10min、15min、20min)，封閉液的種類(10%BSA、5%小牛血清、5%脫脂奶粉)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)同一陽性和陰性樣品。選擇陰性O(shè)D450nm值小于0.1，P/N值最大的條件為最佳條件。

1.2.3判定標(biāo)準(zhǔn)的確定取不同批次傳代的RK-13細(xì)胞，收集上清液作為陰性樣品，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照。計(jì)算被檢RK-13細(xì)胞上清液的平均OD450nm值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，陽性臨界值=陰性樣品X+3SD。

1.2.4定量DAS-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立病毒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀釋，采用優(yōu)化的DAS-ELISA方法進(jìn)行試驗(yàn)，反應(yīng)完畢測(cè)定OD450nm值。以TCID50值為橫坐標(biāo)，OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定相關(guān)系數(shù)和線性關(guān)系式。

1.3特異性檢測(cè)應(yīng)用建立的DAS-ELISA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的特異性。

1.4敏感性檢測(cè)病毒標(biāo)準(zhǔn)品以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀釋，經(jīng)DAS-ELISA方法檢測(cè)，確定該方法的最低檢出限。

1.5穩(wěn)定性檢測(cè)3次包被的酶標(biāo)板重復(fù)檢測(cè)不同TCID50的EAV細(xì)胞上清液，比較結(jié)果，評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1DAS-ELISA檢測(cè)方法反應(yīng)條件的優(yōu)化以MAb2B9為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，MAbHRP-2B3為檢測(cè)抗體；通過方陣試驗(yàn)確定MAb2B9的最佳包被濃度為2μg/mL，最佳包被時(shí)間是4℃12h；MAbHRP-2B3的最佳工作濃度為2μg/mL，最佳反應(yīng)時(shí)間為1h；抗原最佳工作時(shí)間為37℃1h；3種封閉液(10%BSA、5%小牛血清、5%脫脂奶粉)的封閉效果均比較理想，選用5%脫脂奶粉作為封閉液，37℃2h封閉效果最好；TMB顯色最佳時(shí)間為10min(表1)。

2.2DAS-ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定采用20份不同批次傳代的RK-13細(xì)胞上清液作為陰性樣品，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，樣品的X和SD值分別為0.0087和0.012，根據(jù)公式X+3SD計(jì)算，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的臨界值為0.124，即OD450nm值≥0.124判為陽性。

2.3定量DAS-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線抗原的TCID50值和其經(jīng)DAS-ELISA檢測(cè)的OD450nm值之間呈線性關(guān)系，線性方程為y=5×10-5x+0.0651，R2為0.9982(圖1)。

2.4特異性試驗(yàn)以DAS-ELISA方法檢測(cè)EAV、EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4，僅EAV的檢測(cè)值OD450nm>0.124(圖2)，表明該方法在檢測(cè)其他病毒時(shí)無交叉反應(yīng)，特異性好。

2.5敏感性試驗(yàn)病毒標(biāo)準(zhǔn)品以PBS做1∶5～1∶300稀釋，應(yīng)用建立的ELISA方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。1∶200稀釋時(shí)，OD450nm值為0.131>0.124，1∶300稀釋時(shí)，OD450nm值為0.096<0.124，表明該方法的最低檢出限為1∶200(103.2TCID50)。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)3塊不同的酶標(biāo)板(1、2、3)對(duì)倍比稀釋的病毒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)重復(fù)性良好，并且呈線性分布，表明該方法的穩(wěn)定性好。

3討論

雖然近年來我國尚未有分離到EAV的報(bào)道，但賽馬業(yè)的迅速發(fā)展，馬匹交流的頻繁，增加了EVA的傳播風(fēng)險(xiǎn)。OIE指定用于國際貿(mào)易中檢測(cè)EAV的方法是VN[11]。VN應(yīng)用于確診可疑馬，篩選種公馬是否感染EAV，具有良好的特異性和較高的敏感性，但該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長，不易于大批量樣品的檢測(cè)。現(xiàn)有的ELISA方法中，MAb阻斷ELISA方法操作簡單，成本較低，但病毒抗原的制備較為復(fù)雜，很難保證批次的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)建立的DAS-ELISA方法能夠特異性地檢測(cè)EAV，與EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4呈現(xiàn)明顯的陰性反應(yīng)，操作簡單、試驗(yàn)周期短，可以同時(shí)檢測(cè)大批樣本。并且該DAS-ELISA方法具備極好的穩(wěn)定性，包被的酶標(biāo)板在-20℃冰箱保存一個(gè)月，其敏感性和特異性均未變。由于臨床樣本中未發(fā)現(xiàn)感染EVA的病例以及馬匹動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)施的不便，無法開展該方法和其他方法的比較試驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)室階段的研究工作已經(jīng)成熟，為后期診斷試劑盒的開發(fā)提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。該方法對(duì)口岸及養(yǎng)馬場中馬匹的快速檢測(cè)、疫情的發(fā)現(xiàn)和控制具有十分重要的意義。

作者：胡月戚亭趙世華關(guān)平原王曉鈞單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病與慢病毒創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)