貓鉤蟲PCR檢測(cè)方法范文

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《中國獸醫(yī)科學(xué)雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1糞樣和對(duì)照樣品本研究所用的112份流浪貓糞樣采自廣州市某寵物救助站。陽性對(duì)照樣品巴西鉤蟲為美國諾華動(dòng)物保健有限公司StephenEBienhoff博士贈(zèng)送。陽性對(duì)照樣品犬鉤蟲和錫蘭鉤蟲以及陰性對(duì)照樣品貓弓首蛔蟲、犬復(fù)孔絳蟲、狐毛尾線蟲蟲卵，藍(lán)氏賈第蟲包囊、貓等孢球蟲卵囊均為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲病教研室保存。

1．2主要試劑糞便DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品。UNIQ－10柱式pcr產(chǎn)物純化試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。ExTaqDNA聚合酶、pMD18－T載體及JM109感受態(tài)細(xì)胞均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1．3顯微鏡檢查在待檢的貓糞樣品中加入2倍體積的蒸餾水?dāng)噭颍?．246mm的篩網(wǎng)過濾1次，吸取1～2mL過濾液于5mL離心管中，加入2倍體積蒸餾水，4000r／min離心5min，棄上清液，加入2．5mL33．3g／L的硫酸鋅溶液，攪勻，1500r／min離心3min，再加入33．3g／L的硫酸鋅溶液直至加滿離心管，其上放置一蓋玻片，靜置5min后，移開蓋玻片，放置于載玻片上，盧戈氏碘液染色，在40×10倍鏡下檢查。

1．4糞便DNA的提取吸取1．3中的糞便過濾液1．5mL于2mL離心管中，4000r／min離心5min，棄上清液，加入適量的玻璃珠并在－80℃和100℃中反復(fù)凍融5次，然后加入適量的緩沖液和蛋白酶K，漩渦振蕩30min，55℃消化16h。之后，按照糞便DNA提取試劑盒使用說明書提取蟲卵基因組DNA。

1．5PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化擴(kuò)增引物為鉤蟲ITS部分序列的保守引物AF：5′－CTTTGTCGGGAAGGTTGG－3′和AR：5′－TTCACCACTCTAAGCGTCT－3′［12］，預(yù)期擴(kuò)增片段的大小為404bp。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：10×Buffer2．5μL，dNTP5nmol，上、下游引物各25pmol，ddH2O17．3μL，模板2μL，ExTaqDNA聚合酶0．2U。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，51．9～69．5℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7min。根據(jù)不同退火溫度下目的條帶的亮度確定最佳退火溫度。

1．6特異性試驗(yàn)按照1．5中的最佳退火溫度，分別取錫蘭鉤蟲、犬鉤蟲、巴西鉤蟲和陰性對(duì)照的基因組DNA2μL作為模板，同時(shí)設(shè)立滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)2次，檢測(cè)該方法的特異性。

1．7敏感性試驗(yàn)測(cè)定提取的鉤蟲蟲卵基因組DNA濃度，然后按10倍倍比連續(xù)稀釋，每個(gè)倍數(shù)稀釋樣品取2μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)2次，檢測(cè)該方法的敏感度。

1．8PCR方法的臨床檢測(cè)對(duì)112份流浪貓糞樣進(jìn)行3次碘液染色鏡檢，同時(shí)提取糞便DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，比較兩種方法的檢出率。以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，按照診斷試驗(yàn)真實(shí)性評(píng)價(jià)方法計(jì)算PCR方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。計(jì)算方法如下：敏感度＝真陽性／（真陽性＋假陰性）；特異度＝真陰性／（假陽性＋真陰性）；陽性預(yù)測(cè)值＝真陽性／（真陽性＋假陽性）；陰性預(yù)測(cè)值＝真陰性／（假陰性＋真陰性）。PCR擴(kuò)增后，隨機(jī)抽取5個(gè)陽性樣品進(jìn)行切膠并按照膠回收試劑盒說明書回收純化PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物連接到pMD18－T載體上，連接之后的載體轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后將連接產(chǎn)物均勻涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個(gè)菌落，37℃搖床培養(yǎng)6h，菌液PCR鑒定，將含有目的片段的菌液送至北京華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2結(jié)果

2．1PCR最佳退火溫度的篩選溫度梯度PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果顯示，退火溫度為61．2℃時(shí)擴(kuò)增效果最好（見圖1）。

2．2特異性試驗(yàn)特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只有鉤蟲的基因組DNA樣品擴(kuò)增出404bp的條帶（見圖2）。

2．3敏感性試驗(yàn)經(jīng)核酸測(cè)定儀測(cè)定，鉤蟲蟲卵基因組DNA的質(zhì)量濃度為107．2μg／mL。重復(fù)試驗(yàn)顯示，該反應(yīng)體系的最低檢測(cè)限為1∶108的稀釋度，即最低可檢測(cè)1．07fg鉤蟲蟲卵基因組DNA（見圖3）。

2．4臨床初步應(yīng)用兩種方法的檢測(cè)結(jié)果顯示，鏡檢法第1次的檢出率為34．8％，3次的檢出率為43．8％；PCR方法一次的檢出率為43．8％（見表1）。以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)公式計(jì)算，得出該P(yáng)CR檢測(cè)方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100％。測(cè)序結(jié)果顯示，5個(gè)隨機(jī)樣品的序列長(zhǎng)度均為404bp，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，1個(gè)序列（登錄號(hào)：KJ840829）與GenBank中收錄的1株錫蘭鉤蟲ITS序列（登錄號(hào)：KF279136）的一致性為99％，另外4個(gè)序列（登錄號(hào)：KJ840825～KJ840828）與1株犬鉤蟲ITS序列（登錄號(hào)：KC755025）的一致性均為99％。

3討論

貓鉤蟲是一種土源性寄生蟲，其感染性幼蟲在適宜的外界環(huán)境中可存活數(shù)周，污染環(huán)境，造成宿主反復(fù)感染，對(duì)犬貓和人類的健康構(gòu)成潛在威脅。目前大多采取化學(xué)防治的防控措施，但藥物治療對(duì)鉤蟲的再次感染影響甚微，并且長(zhǎng)期的藥物驅(qū)蟲使得輕度感染越來越普遍，造成糞便鏡檢的漏檢率升高。采用重復(fù)糞便鏡檢雖然可以提高檢出率，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，特別是對(duì)于大規(guī)模的鉤蟲病流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，過長(zhǎng)的鏡檢還會(huì)引起糞便中蟲卵的變形或溶解。因此，急需建立一種適合臨床使用的鉤蟲敏感、特異、快速的檢測(cè)方法。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribedspacers，ITS）是介于核糖體18S、5．8S和28SDNA之間的區(qū)域。多項(xiàng)研究表明，ITS序列可以作為鉤蟲的分子標(biāo)記與其他寄生蟲進(jìn)行區(qū)分。因此，本研究根據(jù)鉤蟲ITS部分序列的保守引物建立了貓鉤蟲的PCR檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)中只有貓鉤蟲擴(kuò)增出目的條帶，貓的其他常見寄生蟲沒有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

在敏感性試驗(yàn)中，最低檢測(cè)到1．07fg鉤蟲基因組DNA。上述結(jié)果表明該方法具有較高的特異性和敏感性。在對(duì)112份臨床貓糞的檢測(cè)中，PCR方法的檢出率比首次糞便鏡檢高9％，而與重復(fù)3次的鏡檢結(jié)果一致。近年來，越來越多的PCR檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于人鉤蟲病的診斷，顯示了較高的敏感性和特異性。Schr等比較了糞便鏡檢法和PCR方法對(duì)人體鉤蟲的檢出率，結(jié)果PCR方法的檢出率比糞便鏡檢法高11％。Wang等應(yīng)用糞便鏡檢法和兩種PCR方法同時(shí)對(duì)人糞便中的美洲鉤蟲進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種PCR方法均較糞便鏡檢法敏感。本試驗(yàn)中，以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，PCR方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均達(dá)到了100％。5個(gè)隨機(jī)樣品的測(cè)序結(jié)果顯示序列長(zhǎng)度均為404bp，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)5個(gè)序列與GenBank中收錄的錫蘭鉤蟲和犬鉤蟲的ITS序列一致性達(dá)99％，說明擴(kuò)增結(jié)果正確。另外，該方法運(yùn)用試劑盒，僅對(duì)糞便進(jìn)行簡(jiǎn)單處理即可快速簡(jiǎn)便地提取糞便中的鉤蟲蟲卵DNA，提高了檢測(cè)效率。臨床初步應(yīng)用結(jié)果說明，該方法適用于鉤蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。

作者：胡偉劉遠(yuǎn)佳鄭國超譚立娉羅琴李國清單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院