壁虎醇提物抑制C6的增殖范文

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《中國臨床藥理學(xué)雜志》2015年第二十二期

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，發(fā)生于神經(jīng)外胚層，具有發(fā)病率高、治愈率低、復(fù)發(fā)率高及病死率高等特點，藥物、放射和手術(shù)等組成的綜合治療方案是目前的主要治療方法。常規(guī)的化療藥具有嚴重的不良反應(yīng)，并且易有耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致其療效和應(yīng)用受到了限制［1］。本實驗研究壁虎醇提物(Gekkoethanolextract，GEE)對C6細胞的抗腫瘤活性，并對GEE抗腫瘤的機制進行初步探索。

一、材料與方法

1材料

細胞膠質(zhì)瘤C6細胞株，由中國藥科大學(xué)惠贈。藥品與試劑多疣壁虎，批號:090301，安徽永剛飲片公司生產(chǎn);5－氟尿嘧啶，批號:FA131008，規(guī)格:每支10mL/0.25g，上海海普藥業(yè)生產(chǎn)生產(chǎn)。DMEM干粉，美國Gibco公司生產(chǎn);胰酶、四甲基偶氮唑鹽及Hoechst33258，均美國Sigma公司生產(chǎn);PVDF膜，美國PALL公司生產(chǎn);AIF一抗，北京博奧森公司生產(chǎn);β－actin、caspase－9一抗，北京中杉金橋公司生產(chǎn)。儀器SK3c細胞培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司產(chǎn)品;JM－L研磨機，上海諾尼輕工機械有限公司產(chǎn)品;BX41熒光顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;Minitrans－blot電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國Bio－Rad公司產(chǎn)品。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代，并進行實驗。

2.2GEE的制備雙蒸水400mL與壁虎干粉100g混勻后，研磨4h，離心取沉淀。用55%乙醇溶液醇沉4h后，離心，取上清，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，凍干得GEE干粉，貯于－20℃冰箱備用。

2.3MTT法檢測GEE抑制c6細胞生長實驗將C6細胞(5×104mL－1)200μL接種到96孔板，設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，實驗組加入濃度分別為0.1，0.15，0.2，0.3，0.4mg•mL－1GEE的培養(yǎng)液，并設(shè)對照組(0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶)和空白組，分別處理20，44，68h后，每孔加MTT溶液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加DMSO200μL，振蕩混勻后，測定光密度(A490)值，計算抑制率。

2.4觀察細胞形態(tài)改變以5×104mL－1的細胞濃度接種6孔板，培養(yǎng)24h后給藥。設(shè)置空白組、對照組(0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶)和實驗組(0.1，0.2，0.4，0.6mg•mL－1GEE)，作用24h后，在倒置顯微鏡下觀察C6細胞形態(tài)的改變。

2.5Hoechst33258熒光染色取C6細胞2mL，接種于鋪有蓋玻片的6孔板內(nèi)，細胞貼壁后，分組給藥(同2.4)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用4%多聚甲醛37℃固定10min，置于Hoechst33258染色液中，避光孵育10min。PBS沖洗后，取出蓋玻片，觀察并拍照。

2.6Westernblot法檢測caspase－9與AIF蛋白的表達將C6細胞接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組、實驗組和對照組。空白組不加藥，實驗組分別加0.1，0.2，0.3mg•mL－1GEE培養(yǎng)液，對照組給予0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提蛋白，進行變性PAGE電泳。AIF(1∶500)、caspase－9(1∶500)及β－actin(1∶1000)在4℃孵育過夜，羊抗鼠二抗(1∶1000)室溫下震蕩孵育1h，DAB顯色后觀察并分析結(jié)果。

3統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果數(shù)據(jù)以x珋±s表示，采用SPSS16.0進行統(tǒng)計處理，用單因素方差分析進行樣本均數(shù)的比較。

二、結(jié)果

1GEE對C6細胞增殖的抑制作用藥物作用于細胞24，48，72h后，GEE對C6細胞增殖有抑制作用，可見隨時間的延長和藥物濃度的增加，細胞抑制作用逐漸增強，呈劑量和時間依賴性。實驗組與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2細胞形態(tài)改變的觀察及其改變倒置顯微鏡下觀察，空白組，細胞大小均一，呈梭形，相互連接成網(wǎng)狀。實驗組，突起減少，細胞變圓，貼壁的細胞數(shù)量明顯減少，細胞的胞漿可見空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)的顆粒增多，形成大量的細胞碎片。熒光顯微鏡下觀察，空白組，細胞核形態(tài)較好，呈橢圓形或圓形，可見均勻的藍色熒光。對照組和實驗組，細胞可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為胞核縮小，大小不一，形態(tài)不規(guī)則，并有致密的強熒光團塊，見圖1。

3GEE對C6細胞caspase－9、AIF蛋白表達的影響不同濃度的GEE可誘導(dǎo)caspase－9、AIF蛋白的表達，且有不同程度的升高，與空白組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖2。

三、討論

前文研究發(fā)現(xiàn)，壁虎醇提物可以抑制移植于鼠腎包膜下的H22肝癌瘤塊的生長，并且在體外可誘導(dǎo)人喉癌Hep2細胞凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，GEE能夠抑制C6細胞的增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究表明，caspase－9和AIF蛋白的表達量與GEE的藥物濃度呈正相關(guān)，提示GEE可能通過增加caspase－9和AIF蛋白的表達水平，進而促進C6細胞的凋亡。GEE對C6細胞的增殖有明顯的抑制作用，并誘導(dǎo)C6細胞凋亡，其機制可能與caspase－9和AIF蛋白表達水平上調(diào)相關(guān)。但GEE成分比較復(fù)雜，有待進一步研究。

作者：葛文靜 王建剛 靳穎 李瑞芳 段冷昕 劉玲 單位：河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)與分子生物學(xué)實驗室