人循環(huán)纖維細胞中的表達及功能范文

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《中國病理生理雜志》2016年第四期

［摘要］

目的:研究鈣庫操縱性鈣通道(store-operatedcalciumchannels，SOCC)相關功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2在人循環(huán)纖維細胞中的表達及SOCC對人循環(huán)纖維細胞分化的影響。方法:采集健康人外周靜脈血，分離出單個核細胞，體外培養(yǎng)分化為循環(huán)纖維細胞。采用RT-PCR和real-timePCR檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達情況，并檢測SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化的影響。結果:Real-timePCR檢測結果顯示ORAI1-3和STIM1-2mRNA在循環(huán)纖維細胞中有較高的表達水平，并且SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細胞分化具有明顯的抑制作用。結論:SOCC表達于循環(huán)纖維細胞中，并且影響循環(huán)纖維細胞的分化。

［關鍵詞］

循環(huán)纖維細胞;鈣庫操縱性鈣通道;ORAI1-3;STIM1-2

人循環(huán)纖維細胞是外周循環(huán)中的一種骨髓來源的間充質祖細胞［1］，由CD14+單核細胞分化而來［2］，主要參與組織的修復與纖維化的過程，除此之外，還能作為抗原遞呈細胞激活T淋巴細胞［3］、促進血管生成［4］和穩(wěn)定細胞外基質［5］。在健康個體中，它占有核細胞的比例不到1%［6］。近年來，大量研究證實循環(huán)纖維細胞是肌成纖維細胞的前體［7］，能夠遷移并在肺中募集，可能通過促進平滑肌層增厚［8］、促纖維化和/或促進炎癥過程［3］、促進新血管生成［4］和重建細胞外基質［5］等途徑參與慢性哮喘氣道重塑過程。鈣信號是細胞的重要第二信使，參與了細胞的增殖、分化、遷移和細胞因子分泌等多種功能的調控。細胞內鈣離子濃度升高主要通過肌漿網/內質網等鈣庫中的內鈣釋放和胞外鈣離子內流兩種途徑實現(xiàn)［9］。細胞膜上鈣庫操縱性鈣通道介導的鈣庫操縱性鈣內流是非興奮性細胞外鈣內流的主要途徑［10］。目前發(fā)現(xiàn)ORAI家族蛋白ORAI1-3主要參與SOCC的鈣內流孔道的構成，而STIM家族蛋白STIM1-2主要作為胞內鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時將這一信號傳遞到胞膜的SOCC，促使其開放，介導鈣離子內流。本研究應用real-timePCR檢測了體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細胞中SOCC相關功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2表達情況，并初步探討SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化成熟的影響，為將來深入探討它們在支氣管哮喘病理機制中的功能奠定基礎。

一、材料和方法

1主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、1mmol/LHEPES、100×非必須氨基酸、100mmol/L丙酮酸鈉和100×ITS-3均購自Sigma;青霉素(1×107U/L)/鏈霉素(10g/L)混合液(100×)和200mmol/L谷氨酰胺購自Hy-Clone;平底24孔組織培養(yǎng)板購自BDBiosciences;人CD14+單核細胞負選磁珠購自DynalBiotech;TRITC連接的鼠抗人CD45和I型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)抗體、驢抗兔IgGH＆L(FITC)II抗及SKF-96365購自Abcam;TRIzol、DNA處理酶I和逆轉錄酶SSⅢ購自Invitrogen;高保真Taq酶和SYBRPremixExTaqTM購自TaKaRa。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據設計合成。

2主要方法

2.1人循環(huán)纖維細胞的分離及培養(yǎng)用肝素抗凝管采集每位健康志愿者(來自武漢大學醫(yī)學院，均簽署書面知情同意書)外周血50mL，用pH7.4無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積稀釋后，用等體積的淋巴細胞分離液分離，2000r/min離心20min，小心吸取白膜。用至少3倍體積的無菌PBS洗滌白膜，1500r/min離心15min，輕輕吸除上清。分離所得的細胞即為外周血單個核細胞。加500μL隔離緩沖液(0.1%BSA和2mmol/LEDTA的無Ca2+及Mg2+的PBS)輕輕混勻細胞，用DynabeadsUntouchedTM人單核細胞磁珠負選試劑盒得CD14+單核細胞。用無血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基［含10mmol/LHEPES，2mmol/L谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2%BSA，1×ITS-3(5mg/L胰島素，5mg/L轉鐵蛋白，5μg/L亞硒酸鈉)，1mmol/L丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸］1mL重懸細胞，吹打混勻。將所得的細胞按2.5×109/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板內，每孔2mL，然后將培養(yǎng)板置于含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)7d，觀察細胞形態(tài)變化。

2.2人循環(huán)纖維細胞的鑒定(1)形態(tài)學鑒定:按上述方法培養(yǎng)7d后，光鏡下觀察，呈紡錘狀的長梭形貼壁細胞即為循環(huán)纖維細胞。(2)免疫組織化學鑒定:將分離的細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內，置于37℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d，然后選擇分化較好的細胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞3次，加入TRITC連接的CD45抗體，4℃孵育30min后，細胞清洗3次。用250μL的固定破膜劑重懸細胞，4℃固定破膜20min。加入PBS溶液2mL，輕輕晃動培養(yǎng)皿，洗滌細胞3次，用含2%牛血清白蛋白的PBS室溫封閉60min。加ColⅠ的I抗，4℃過夜。再用2mLPBS清洗細胞3次后，加入FITC標記的驢抗兔IgG的II抗，4℃暗室孵育，過夜。2mLPBS清洗細胞3次后，加入PBS，熒光顯微鏡下觀察CD45和ColI的表達情況。

2.3RT-PCR及Real-timePCR檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達情況將分離得到的CD14+單核細胞按2.5×108/L的密度接種到24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7d。取樣后每管加入1mLTRIzol進行RNA抽提，最后每管RNA晾干后加40μL滅菌0.1‰DEPC處理雙蒸水溶解RNA沉淀。取2μg總RNA至1.5mL離心管中進行反轉錄，所使用DNaseI和逆轉錄酶SSⅢ均來自Invitrogen，反轉錄完成后生產的cDNA產物補雙蒸水至50μL。RT-PCR檢測采用的反應體系為:0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，2μLdNTPs(2.5mmol/L)，2μL10倍緩沖液，0.2μLExTaq，2μL反轉錄cDNA產物為模板，最后補滅菌雙蒸水至20μL;反應條件為:為94°C5min;94°C15s，60°C30s，72°C30s，共28循環(huán);72°C5min。反應完成后PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。Real-timePCR檢測基因表達量采用的反應體系是10μLSYBRPremixExTaqTM，0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，0.4μLROXReferenceDyeⅡ(10μmol/L)，2μL反轉錄cDNA產物，最后補滅菌雙蒸水至20μL。Real-timePCR反應程序為:94°C10s;94°C5s，60°C38s，40循環(huán);95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。RT-PCR以及real-timePCR所用引物見表1。

2.4SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化的影響將分離得到的PBMCs按2.5×108/L的密度接種到24孔板內;分組情況如下:分別設置空白對照組和SOCC抑制劑SKF-96365干預組:選擇1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L多個濃度梯度;37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d，然后于10倍光學顯微鏡下觀察循環(huán)纖維細胞分化的情況，隨機取5個視野拍照，并進行細胞計數。

3統(tǒng)計學處理本實驗中所有數據均在Excel中完成分析，數值計量資料均以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1循環(huán)纖維細胞的鑒定將分離所得PBMCs用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，光鏡下可見部分貼壁細胞分化為長梭形，形態(tài)上符合已分化的循環(huán)纖維細胞的特征(圖1)，與文獻報道一致［11］;免疫組織化學檢測細胞分子標記的表達情況，冰丙酮固定細胞并破膜后，用TRITC連接的CD45抗體和FITC連接的ColI抗體對細胞進行染色，經生物素親和素的信號放大作用，熒光顯微鏡下可同時觀察到TRITC的紅色熒光和FITC的綠色熒光，證實梭形細胞能夠同時表達CD45和ColI分子。

2RT-PCR和real-timePCR檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3和STIM1-2的mRNA表達RT-PCR結果顯示各基因引物特異性良好，條帶特異且PCR產物大小符合預期，同時也表明了這批引物能夠用于real-timePCR檢測，凝膠電泳檢測結果見圖3。進一步使用這些引物我們在6個志愿者的人體循環(huán)纖維細胞中對ORAI1、ORAI2、ORAI3、STIM1和STIM2進行了real-timePCR的檢測。結果顯示，ORAI1mRNA的表達量明顯高于ORAI2和ORAI3;而STIM1mRNA的表達量也高于STIM2，表明ORAI1和STIM1是循環(huán)纖維細胞SOCC的主要構成和調節(jié)分子，見圖4。

3SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細胞分化的影響SKF-96365是SOCC的非特異性抑制劑，研究表明在SKF濃度為10μmol/L時，基本上對細胞無毒害作用［12］。如圖5所示，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PBMCs在加入較低濃度(1μmol/L和3μmol/L)的SKF-96365時，循環(huán)纖維細胞的分化過程即受到明顯的抑制，且具有很強的濃度依賴性，即濃度越高抑制越明顯。當SKF-96365的濃度為10μmol/L時，能抑制大部分循環(huán)纖維細胞的分化。

三、討論

氣道重塑是慢性哮喘的重要特征，其病理改變包括氣道上皮下纖維化及肌成纖維細胞聚積［13］。許多研究都表明循環(huán)纖維細胞是參與哮喘結構和功能損害的重要因素。最早在2003年Schmidt等［14］發(fā)現(xiàn)在哮喘患者的氣道中含有循環(huán)纖維細胞(CD45+/CD34+和ColI為識別標記)，而且這些細胞隨著患者接觸過敏原增多而數量增多。一項獨立研究發(fā)現(xiàn)嚴重難治性哮喘患者的支氣管活檢樣本中支氣管壁中循環(huán)纖維細胞數量較正常組明顯升高，而外周血中的循環(huán)纖維細胞數量也明顯升高［8］。最近一項臨床研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中的循環(huán)纖維細胞數量與哮喘的嚴重程度呈正相關，可以作為臨床嚴重哮喘的生物學標志［15］。SOCC是非興奮性細胞胞外Ca2+內流的主要通道，參與了基因轉錄、細胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應激等多種生理和病理生理過程。有研究表明ORAI1和STIM1兩種蛋白是構成SOCE通道的重要組成部分。ORAI是近年來發(fā)現(xiàn)的一種位于細胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動物ORAI家族中有3個成員:ORAI1、ORAI2和ORAI3，其中ORAI1是最重要的SOCE的效應蛋白。研究表明ORAI1可以和ORAI2、ORAI3復合體來介導SOCE［16］。STIM家族成員包括STIM1和STIM2。在哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)STIM1是SOCC的重要調節(jié)分子，而STIM2主要與維持鈣庫的穩(wěn)定有關。STIM1是分子量為77kD的跨膜蛋白，主要位于ER膜上，它具有感受鈣池充盈狀態(tài)并將感受信號通過不同蛋白作用機制傳遞給ORAI及TRPC通道的雙重功能，是共同介導SOCE的關鍵分子［17］。我們的mRNA表達研究表明，體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細胞均表達這些SOCC相關蛋白，其中以STIM1和ORAI1的表達最為豐富，提示STIM1和ORAI1是循環(huán)纖維細胞SOCC的主要構成分子和調節(jié)分子。

單核細胞是循環(huán)纖維細胞的前體，SOCC介導的鈣離子內流參與單核細胞的激活、增殖、分化及細胞因子的分泌等多種生理過程［18］。我們的既往研究顯示，在單核細胞分化而來的巨噬細胞和樹突狀細胞［12，19］，SOCC發(fā)揮了重要功能，對樹突狀細胞的成熟和抗原遞呈等功能具有調節(jié)作用，并有可能參與哮喘氣道炎癥過程。循環(huán)纖維細胞同樣由單核細胞分化而來，因此，理論上SOCC同樣會發(fā)揮功能調控作用。我們的研究結果證實了SOCC調控循環(huán)纖維細胞的分化過程。成纖維細胞和肌成纖維細胞可由循環(huán)纖維細胞分化而來，其基因表達和炎癥介質釋放等多種細胞功能調控與非選擇性的SOCC密切相關［20-21］。因此，循環(huán)纖維細胞的分化以及其進一步的分化為成纖維細胞和肌成纖維細胞的過程均受到SOCC的影響，提示SOCC可以作為一個節(jié)點分子，調節(jié)循環(huán)纖維細胞參與的病理生理過程，比如慢性哮喘的氣道重塑過程。下一步我們將用體內實驗進一步驗證SOCC抑制后對循環(huán)纖維細胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用的影響。本實驗結果顯示循環(huán)纖維細胞表達SOCC相關基因，并且SOCC的活性影響循環(huán)纖維細胞的分化，表明SOCC是循環(huán)纖維細胞功能的重要調節(jié)機制。

作者：鐘金男 蘭蘭 何光珍 黃革 楊炯 高亞東 單位：武漢大學中南醫(yī)院呼吸內科