人原代白血病細(xì)胞的體外研究范文

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《藥物評價研究雜志》2015年第三期

1方法

1.1形態(tài)學(xué)觀察原代白血病細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/mL，按每孔2mL接種于6孔板中。實驗組加入終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL的苦參堿藥液，陰性對照組加入等體積1640培養(yǎng)液，作用24、48h后倒置光學(xué)顯微鏡下觀察白血病細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2苦參堿對原代白血病細(xì)胞作用濃度–時間曲線的測定原代白血病細(xì)胞調(diào)整密度為1.5×105/mL，按每孔1mL接種于24孔板中。實驗組加入苦參堿藥液，終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL，陰性對照組加入等體積1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6個平行孔。細(xì)胞于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天各實驗組取出1孔，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)計數(shù)6次，繪制苦參堿對白血病細(xì)胞的作用濃度和時間曲線。每個實驗至少重復(fù)3次。

1.3CCK-8增殖實驗原代白血病細(xì)胞調(diào)整密度為2×105/mL，按每孔200μL接種于96孔板中。實驗組加苦參堿藥液，終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL，另設(shè)不加藥組為對照組，無細(xì)胞單加藥組為空白組，每組設(shè)3個平行孔。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48h后，CCK-8法檢測苦參堿對細(xì)胞的影響。細(xì)胞增殖活性計算公式：[（實驗組A450－空白組A450）/（對照組A450－空白組A450）]×100%。每個實驗至少重復(fù)3次。

1.4AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡原代白血病細(xì)胞調(diào)整密度為2×105/mL，按每孔3mL接種于6孔板中。實驗組分別加入0.2、0.5、0.8mg/mL苦參堿處理。24h后，收集細(xì)胞以預(yù)冷0.01mol/LPBS洗滌2次，以100μL1×Annexin-bindingbuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在1×106個/mL，實驗組和對照組細(xì)胞內(nèi)依次加入5μLAnnexin-V和1μLPI工作液；另設(shè)Annexin-V和PI單染對照，分別加入5μLAnnexin-V或1μLPI工作液；避光室溫孵育15min，各管內(nèi)加入400μL1×Annexin-bindingbuffer，混勻避光至于冰上。以FITC標(biāo)記的Annexin-V和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。每個實驗至少重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞周期分析原代白血病細(xì)胞調(diào)整密度為2×105/mL，按每孔5mL接種于6孔板中。實驗組分別加入終質(zhì)量濃度0.2、0.5、0.8mg/mL苦參堿處理。48h后，收集細(xì)胞以預(yù)冷0.01mol/LPBS洗滌2次，以500μL冰70%乙醇固定細(xì)胞，−20℃過夜。后離心棄上清，以預(yù)冷0.01mol/LPBS洗滌2次，實驗組和對照組細(xì)胞內(nèi)依次加入100μLTritonX-100（0.1%）破膜，5min。后離心棄上清，以預(yù)冷0.01mol/LPBS洗滌2次，加入終質(zhì)量濃度0.2mg/mLRNeA，50μg/mLPI，避光室溫孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期情況。每個實驗至少重復(fù)3次。1.3統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)用采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行組間兩兩比較。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察原代白血病細(xì)胞經(jīng)苦參堿處理前后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。見圖1，對照組經(jīng)24h培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)量略有增加，形態(tài)呈圓形透亮狀，折光性減弱，胞質(zhì)中出現(xiàn)細(xì)顆粒狀物質(zhì)；而經(jīng)苦參堿處理24h，細(xì)胞數(shù)量雖有增加，但胞體脹大，內(nèi)有空泡，核內(nèi)染色質(zhì)固縮，可見死亡細(xì)胞及碎片。培養(yǎng)48h后，對照組細(xì)胞略有增加，細(xì)胞形態(tài)脹大，可見些許死亡細(xì)胞及碎片；苦參堿處理組細(xì)胞數(shù)量減少，核內(nèi)染色質(zhì)固縮，細(xì)胞破裂降解，細(xì)胞開始大量死亡。

2.2苦參堿抑制原代白血病細(xì)胞的增殖活性不同濃度苦參堿對原代白血病細(xì)胞的生長均顯示抑制作用，呈藥物濃度相關(guān)性。由圖2A生長曲線可見，隨著苦參堿處理濃度的增加，細(xì)胞的增值速度減慢。苦參堿0.2mg/mL組48h細(xì)胞計數(shù)為（15.33±1.04）×104，苦參堿0.5mg/mL組為（9±0.87）×104，對照組為（17.83±1.26）×104。隨著苦參堿作用時間的延長，處理組細(xì)胞數(shù)減少更加明顯。5d時，苦參堿0.2、0.5、0.8mg/mL組細(xì)胞計數(shù)依次為（10±1）×104、（6.67±1.15）×104、（5.67±0.58）×104。隨著苦參堿處理濃度的增加，抑制作用逐漸增強，見圖2B。24h苦參堿處理組細(xì)胞活性依次為（66.10±11.02）%、（45.02±18.21）%、（27.04±7.89）%。其中0.5、0.8mg/mL與對照組差異顯著（P＜0.01）。而且0.2mg/mL與0.8mg/mL之間也存在顯著差異（P＜0.05）。苦參堿處理時間延長后，48h苦參堿0.2mg/mL組細(xì)胞活性為（79.68±6.59）%，抑制作用有所減弱；苦參堿0.8mg/mL組細(xì)胞活性為（25.88±21.01）%，抑制作用略有增加，但是差異無顯著性。苦參堿對原代白血病細(xì)胞的抑制作用呈劑量相關(guān)性，其中苦參堿0.5mg/mL在24、48h均呈現(xiàn)半數(shù)抑制。

2.3苦參堿誘導(dǎo)原代白血病細(xì)胞凋亡苦參堿對原代白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用具有劑量相關(guān)性，見圖3。苦參堿作用24h，對照組的細(xì)胞凋亡率約為8.71%，隨著苦參堿加藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡率分別為13.37%、40.62%、63.21%，其中早期凋亡率分別為11.8%、37.6%、54.7%。2.4苦參堿阻滯原代白血病細(xì)胞于G0/G1→S期苦參堿處理48h后，原代白血病細(xì)胞的周期發(fā)生改變。其中G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S和G2期細(xì)胞比例顯著降低，見圖4。G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，其中對照組為74.7%，苦參堿0.5mg/mL組為88.06%，苦參堿0.8mg/mL組為90.4%。S和G2期細(xì)胞比例顯著降低，S期對照組為8.22%，苦參堿0.5mg/mL組為4.42%。G2期對照組為17.08%，苦參堿0.2、0.5、0.8mg/mL組依次為16.75%，7.52%，2.48%。顯示細(xì)胞周期阻滯于G0/G1→S期。

3討論

白血病是一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國青少年中發(fā)病率較高，其高度增生和惡性侵襲的生物學(xué)特性使其臨床防治始終是一個難點。白血病的常規(guī)療法主要是放療和化療，但是由于缺乏選擇特異性，往往對正常組織、器官（特別是骨髓和消化道）造成功能性或器質(zhì)性損傷。因此，尋找新的治療方法和有效的抗癌藥物具有重要意義。中草藥以其副作用小，價廉易得在腫瘤綜合防治中越來越受到關(guān)注。苦參堿是提取于豆科植物苦參、苦豆子、廣豆根等中草藥的活性成分。近年來，有關(guān)苦參堿類抗腫瘤機制的研究目前已成為抗腫瘤中藥研究的一個熱點，研究結(jié)果表明作為抗腫瘤聯(lián)合用藥在腫瘤綜合防治中具有較好的應(yīng)用前景。以往研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能明顯抑制人慢粒白血病細(xì)胞K562、早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、U937細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡增加，其中抑制K562細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制；誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病JM多個凋亡基因差異表達(dá)，其中Cpe8表達(dá)上調(diào)5倍以上。以上這些都是在白血病細(xì)胞株中的研究，苦參堿對原代白血病細(xì)胞的作用尚沒有更多報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對原代白血病細(xì)胞也具有明顯的增殖抑制作用，呈劑量相關(guān)性。隨著時間的延長，其抑制效應(yīng)有所減弱，但高濃度仍具有較強抑制效果，苦參堿0.5mg/mL在24、48h均呈現(xiàn)半數(shù)抑制。細(xì)胞凋亡也與腫瘤之間關(guān)系密切，正常細(xì)胞通過增生和凋亡來維持自身穩(wěn)定，若兩者失衡，則會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本次研究，24h苦參堿誘導(dǎo)凋亡作用顯著，其中早期凋亡占較大比例。腫瘤細(xì)胞的無限增殖與細(xì)胞周期的失控有關(guān)，G1/S是其重要的調(diào)控點。本次研究，苦參堿處理48h，原代白血病細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S和G2期細(xì)胞比例顯著降低，顯示細(xì)胞周期阻滯于G0/G1→S期。本課題組在以往研究中發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以抑制K562細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡、分化，其作用可能與Bcl-2、C-myc、CyclinD1、P53的表達(dá)有關(guān)。有報道稱苦參堿作用后的K562、HL-60細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯的下調(diào)，與苦參堿濃度呈反比。近年來的研究表明Bcl-2在內(nèi)源性凋亡途徑中起著重要作用。另外，苦參堿作用K562細(xì)胞后，P53表達(dá)增強。P53是一種腫瘤抑制基因，對細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)有調(diào)控作用。此外，苦參堿作用K562細(xì)胞后，伴隨著DNA合成能力的降低，C-myc的mRNA水平表達(dá)降低，CyclinD1表達(dá)增強并幾乎同步達(dá)到最高。C-myc、CyclinD1作為一種細(xì)胞周期蛋白，其表達(dá)水平受苦參堿影響，在G0期到S期的過程中起重要作用。因此，推測苦參堿對原代白血病細(xì)胞生長抑制作用可能與Bcl-2，C-myc基因表達(dá)水平的下調(diào)，CyclinD1表達(dá)增強，P53活化有關(guān)。以往的研究提供了一些可能，苦參堿抑制原代白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1→S期，其作用機制是否與這些分子相關(guān)，還有待更深入的研究。這些涉及到的相關(guān)分子將是本課題組下一步的研究方向。

作者：白煜 朱志超 蔣麗佳 夏蕾 范靜 孫曉 盧緒章 周民 馬玲娣 單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 中心實驗室 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院血液科