含抑制物檢材中多重置換擴增的運用范文

本站小編為你精心準備了含抑制物檢材中多重置換擴增的運用參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《法醫學雜志》2016年第5期

摘要：

目的研究多重置換擴增在含抑制物檢材中的抗抑制能力，與磁珠法純化檢材相比較，證明其在法醫學中的應用及意義。方法將不同濃度血紅素和腐殖酸與樣本DNA進行混合，分為MDA處理組、磁珠法處理組和空白對照組，PCR-STR單基因座D3S1358擴增聯合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并應用AmpF詛STR誖IdentifilerTMPlus試劑盒聯合毛細管電泳檢測。結果血紅素質量濃度大于1ng/μL或腐殖酸質量濃度大于0.1ng/μL時，空白對照組經單基因座STR檢測不能得到擴增產物；磁珠法處理組血紅素質量濃度大于100ng/μL或腐殖酸濃度大于1ng/μL時，不能夠得到擴增產物；MDA處理組各濃度抑制物均能成功擴增，完全不受抑制物影響。結論MDA技術可消除血紅素及腐殖酸的抑制作用，其抗抑制能力優于磁珠法純化DNA，具有一定的法醫學應用意義。

關鍵詞：

法醫遺傳學；核酸擴增技術；多重置換擴增；抑制物；血紅素；腐殖酸

犯罪現場提取的DNA樣本常受載體所含抑制物（血紅蛋白、紡織品染料、泥土中的腐殖酸等）的影響，致使PCR擴增失敗。多重置換擴增技術，作為全基因組擴增技術之一，針對含抑制物檢材，其反應體系中原始模板所占比例甚小，在模板被稀釋的同時，抑制物亦被稀釋，使其對擴增的影響明顯減弱，甚至可以忽略不計[1]。此外，應用該技術進行擴增時，體系中的DNA量會隨反應的進行而不斷增多，抑制物的含量卻保持不變，可以大大減少其抑制作用。本研究選擇了兩種較常見的PCR抑制物，應用MDA技術處理含抑制物樣本，并與磁珠純化法相比較，對該技術的抗抑制能力進行評估。

1材料與方法

1.1樣品

已知隨機個體靜脈血液樣本2份，每份5mL，枸櫞酸鈉抗凝，-20℃保存。血液樣本由中國醫科大學法醫血清教研室提供。

1.2主要儀器與試劑

3130xl型遺傳分析儀（美國AB公司）。Plus試劑盒（美國AB公司），REPLI-g試劑盒［德國凱杰生物技術（上海）有限公司］，磁珠法微量基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，血紅素、腐殖酸（美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司）。

1.3方法

1.3.1DNA提取

取血樣各1mL，采用酚-氯仿法提取樣品DNA，紫外分光光度法測量DNA質量濃度，用去離子水稀釋到10ng/μL。

1.3.2含抑制物樣品制備

用1molNaOH制備血紅素儲存液（5g/L），加入鹽酸中和至中性，用蒸餾水分別稀釋為質量濃度1000、100、10、1、0.1、0.01ng/μL，各取1μL加入9μLDNA樣品中，制成含血紅素抑制物樣品。用不同倍數蒸餾水稀釋腐殖酸儲備液，分別加入等量的DNA樣品中，使其終質量濃度分別為100、10、1、0.5、0.1、0.01ng/μL。將不同濃度的樣品均分為3份，其中2份分別進行MDA（MDA處理組）和磁珠法純化（磁珠法處理組），另1份不做任何處理（空白對照組）。

1.3.3多重置換擴增

1.3.3.1模板變性

將以上含抑制物樣品取1μL（10ng）加入1.5μL的去離子水中，向樣品中加入2.5μL變性緩沖液D1（DLB緩沖液9μL和無菌水32μL），振蕩均勻后短暫離心，室溫放置3min；加入5μL中和緩沖液N1（終止液12μL和無菌水68μL），振蕩混勻后短暫離心。

1.3.3.2擴增體系和反應條件

擴增體系為50μL，包括29μLREPLI-g緩沖液、1μLREPLI-gDNA聚合酶，無菌水10μL，變性后模板10μL。30℃等溫全基因組擴增10~16h，65℃3min變性，MDA產物用去離子水稀釋50倍，-20℃保存備用。

1.3.4磁珠法純化DNA

各取1μL含抑制物DNA樣本，按照磁珠法微量基因組DNA抽提試劑盒操作手冊進行純化，得到的純化產物置于-20℃保存。

1.3.5PCR-STR

1.3.5.1單基因座D3S1358擴增及檢測

分別以MDA處理組、磁珠法處理組和空白對照組的樣本為模板，進行基因座D3S1358擴增（F：5′-ACTGCAGTCCAATCTGGGT-3′，R：5′-ATGAAATCAACAGAGGCTTG-3′）。擴增體系為20μL：1×PCR緩沖液，rTaq聚合酶1U，4種dNTP各0.2mmol，上、下游引物各5μmol，模板2μL。擴增條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，循環30次；72℃10min。用非變性聚丙烯凝膠（T=8%，C=3%）電泳檢測擴增產物。電泳緩沖液均為1×TBE，160V電泳90min。10%GenefinderTM熒光染料20μL慢搖10min后，熒光染色顯色，紫外光下觀察結果。

1.3.5.2STR復合擴增及檢測

應用AmpF詛STR誖IdentifilerTMPlus試劑盒，以MDA處理組、磁珠法處理組和空白對照組的樣本為模板，檢測其復合STR分型結果。采用10μL擴增體系，反應體系：MasterMix4μL、PrimerSet2μL、去離子水3μL、模板DNA1μL。熱循環參數參照試劑盒的標準PCR擴增程序：95℃11min；94℃20s，59℃2min，72℃1min，循環29次；60℃10min。以DNA標準品9947A為陽性對照，TE緩沖液為陰性對照。采用3130xl型遺傳分析儀進行檢測分析，采用GeneMapperIDv3.22軟件計算片段長度和等位基因判型。等位基因的辨認通過與等位基因分型標準物（Ladder）比較來確定，窗口范圍為±0.5bp。有效峰高定義為≥100相對熒光強度（relativefluorescenceunits，RFU）。

2結果

2.1單基因座D3S1358擴增結果

2.1.1含血紅素樣品擴增產物檢測結果

三組樣品分別進行D3S1358基因座擴增后，得到的電泳檢測結果如圖1。空白對照組血紅素質量濃度大于1ng/μL，無法得到擴增產物；磁珠法處理組質量濃度大于100ng/μL時，無法得到擴增產物；MDA處理組各質量濃度均可得到良好的擴增產物。

2.1.2含腐殖酸樣本擴增產物檢測結果

三組樣品進行D3S1358擴增結果分別見圖2。空白對照組腐殖酸質量濃度大于0.1ng/μL，無法得到擴增產物；磁珠法處理組質量濃度大于1ng/μL時，無法得到擴增產物；MDA處理組各質量濃度均可得到良好的擴增產物。

2.2STR復合擴增結果

含血紅素抑制物MDA處理前后的樣品，復合擴增后均能得到完整的分型結果。當腐殖酸質量濃度為100ng/μL時，空白對照組DNA樣品復合擴增后，出現基因座和等位基因的缺失，無法得到完整的STR分型結果（圖3）；經磁珠法處理后，出現基因座和等位基因的缺失，無法得到完整的STR分型結果（圖4）；經MDA處理后，各位點均可以得到正確的STR分型（圖5）。

3討論

3.1法醫學PCR抑制物

在法醫學實踐中，常見的抑制物有土壤腐殖質、染料、色素、蛋白、尿素、單寧酸、膠原蛋白Ⅰ、多糖和膽鹽等，這些常見的抑制物不僅會影響DNA提取時細胞的裂解、DNA擴增模板、DNA酶的活性等PCR反應的各個環節，而且在定量分析時有很大的干擾作用。血紅素，又稱為亞鐵血紅素，是血紅蛋白分子上的主要穩定結構，在人類血液和肌肉中最為常見。在法醫學中常見于陳舊的血痕，在進行血痕的DNA分析過程中，血紅素最主要的PCR抑制作用就是可逆地阻礙聚合酶的活性位點，從而抑制DNA聚合酶的活性。腐殖酸，作為土壤中的常見物質，是從土壤里提取的檢材中最為常見的抑制物，平均每克土壤含有5.00~7.63mg腐殖酸復合物[2]，土壤中游離的DNA能夠很快地吸收并結合腐殖酸，由于腐殖酸具有與DNA核糖磷酸鹽骨架上磷酸基團相似的理化性質，在DNA的提取純化過程中競爭性結合DNA的吸收位點，因此在DNA提取過程中有土壤中的大部分腐殖酸都會與核酸同時提取出來。以往研究[3]表明，0.08ng/μL的腐殖酸就可以抑制最敏感的Taq聚合酶，0.5~17.0ng/μL的腐殖酸可以抑制限制性內切酶。針對含抑制物檢材的檢測，傳統的方法往往需要首先確定所含抑制物的種類，選擇相應的方法進行抑制物的去除；當無法明確檢材所含抑制物的種類時，往往采用稀釋法。近年來廣泛應用磁珠法可以通過對DNA樣品進行純化從而達到去除抑制物的作用，然而在純化的過程中，不僅難以去除與DNA結構相似的抑制物，同時也會造成樣品的損失，不利于后續遺傳標記的分析。本實驗選擇含血紅素和腐殖酸抑制物的DNA樣品作為研究對象，選取兩種不同機制抑制物，以探求MDA抗抑制能力。結果表明，血紅素在DNA樣品中質量濃度為0.01~1000ng/μL、腐殖酸在DNA樣品中質量濃度為0.01~100ng/μL時，經過MDA處理后都可以得到相應的擴增產物。當血紅素質量濃度超過100ng/μL或者腐殖酸質量濃度超過1ng/μL時，應用磁珠法純化DNA無法得到相應的擴增產物。為了研究MDA在法醫實踐中的可行性，應用復合擴增試劑盒進行常規檢測，由于AmpF詛STR誖IdentifilerTMPlus試劑盒對血紅素有良好的抗抑制能力，其抗抑制能力達到500μmol，本實驗設置的血紅素質量濃度不足以抑制復合擴增。然而，在含腐殖酸抑制物樣品中，當腐殖酸質量濃度大于100ng/μL時，未經處理樣本無法得到完整分型結果；經過磁珠法處理的樣品在純化過程中不僅沒有去除抑制物，而且出現了大量DNA的損失，沒有得到擴增結果；經過MDA處理后，不僅得到了完整分型結果，且沒有發現額外峰和過度擴增現象。血紅素和腐殖酸兩種抑制物不僅沒有影響MDA的擴增效率，且針對其擴增產物進行后續STR分析時，MDA技術可以在保證擴增忠實度的前提下，消除該兩種抑制物的抑制作用。MDA技術是在恒溫條件下以環狀或線性DNA為模板，在有鏈置換活性和核酸外切酶活性的φ29DNA聚合酶作用下，通過耐核酸外切酶活性的隨機引物與模板退火而進行擴增的一種全基因組擴增技術。其中，φ29DNA聚合酶是一種具有很強活性的高保真鏈置換活性的DNA聚合酶，具有低擴增偏倚、高擴增產物長度、低錯配率和高DNA產量等特點[4]。Ballantyne等[5]的實驗證實，使用GenomiPhi試劑盒進行MDA時，染料和腐殖酸均不會對擴增產生影響，但對含亞鐵血紅素的血樣擴增成功率不高。本研究中抑制物并沒有抑制該聚合酶的活性或者阻礙擴增反應的進行，由于其產物量穩定的特點，樣品中DNA濃度增大，而PCR抑制物在50μL的擴增體系中稀釋了50倍，使得抑制物濃度相對DNA濃度大大降低，其抗抑制物能力遠遠高于磁珠法純化DNA。

3.2法醫學應用MDA技術

在法醫學疑難檢材中有良好的應用前景，由于其良好的抗抑制物能力，可以被廣泛地應用于含抑制物檢材、微量檢材和低拷貝檢材。特別是針對多種情況并存的疑難檢材，在進行遺傳標記分析時應用該項技術進行前處理可以大大提高疑難檢材的DNA檢出率。本實驗選取了具有代表性的兩種PCR抑制物進行研究，針對其他種類的抑制物在常規STR檢測中的效果，仍需要進一步探索和研究。

參考文獻：

[1]劉維瑜，金春蓮.多重置換擴增——一種新的全基因組擴增技術[J].國際遺傳學雜志，2007，30（4）：265-268.

作者:丁東雪 丁梅 單位:中國醫科大學法醫學院法醫血清教研室