豚鼠封閉群的遺傳學(xué)研究范文

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1方法

1.1基因組DNA的提取:采取心臟采血，每只豚鼠采500μL血樣，并立即注入4mLEDTA抗凝真空采血管中，充分搖勻并編號。參照《分子克隆指南》及LoparevVN等方案，NaI法提取抗凝血基因組DNA。

1.2PCR擴(kuò)增:25μL反應(yīng)體系:滅菌ddH2O18.3μL;10×PCRbuffer(Mg2+)2.5μL;dNTP(2mM)2.0μL;上游引物(10pmol/μL)0.5μL;下游引物(10pmol/μL)0.5μL;;模板(30ng/μL)1.0μL;Taq酶(2.5U/μL)0.2μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR試劑為寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3等位基因分離:2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，篩選出擴(kuò)增效果好的產(chǎn)物進(jìn)行STR掃描。共選取三種熒光標(biāo)記，分別為FAM、HEX和TAMRA。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:用GeneMapper4.0軟件分析STR掃描結(jié)果，讀取等位基因片段大小，通過PopGen1.32軟件計算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、F-統(tǒng)計量、Shannon信息指數(shù)、Nei遺傳相似度及遺傳距離等指標(biāo)。在線軟件GenePop對各位點進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗及雜合子缺失檢驗。PIC_CALC軟件對每個位點進(jìn)行多態(tài)信息含量(PIC)分析。

2結(jié)果與分析

2.1各微衛(wèi)星位點在總?cè)后w上的遺傳分布統(tǒng)計25個微衛(wèi)星位點在兩個豚鼠群體各個體的基因型，計算各位點的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)信息含量、F-統(tǒng)計量，結(jié)果見表2。25個微衛(wèi)星位點在兩個群體中共發(fā)現(xiàn)121個等位基因，每個位點2～10個，平均4.84個。有效等位基因數(shù)在1.0812～7.0865之間，平均為3.148;觀察雜合度在0.0781～0.8281之間，平均為0.4726;期望雜合度在0.0757～0.8656之間，平均為0.6070;Shannon信息指數(shù)在0.165～2.0572之間，平均為1.1702;多態(tài)信息含量(PIC)在0.072～0.843之間，平均為0.552。

2.2兩群體遺傳多樣性比較如表3所示，A群和B群分別檢測到103和116個等位基因;平均觀察雜合度分別為0.4467和0.5062;平均期望雜合度分別為0.5195和0.5838;平均多態(tài)信息含量分別為0.459和0.518。可以看出，B群的豚鼠群體遺傳多樣性稍大于A群。

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗本研究采用馬可夫鏈法［17］計算兩個群體每個位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的精確P值［P(HWE)］、雜合子缺陷P值［P(ht．def)］與雜合子過多的P值［P(ht．exc)］，并計算相應(yīng)的Fis(W＆C)和Fis(R＆H)，結(jié)果見表4。A種群有5個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡［P(HWE)＜0.05］，偏離平衡的這5個位點中有4個表現(xiàn)出雜合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］;B種群有6個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡［P(HWE)＜0.05］，偏離平衡的這6個位點中有5個表現(xiàn)出雜合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］。

2.4群體間遺傳關(guān)系遺傳分化系數(shù)(Fst)和遺傳距離結(jié)果見表2。兩個群體25個位點的Fst范圍從0.0043到0.4656，平均為0.1056。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204。

3討論

3.1兩個封閉群豚鼠遺傳多樣性有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，反映了等位基因的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個指標(biāo)。雜合度或群體平衡狀態(tài)是群體遺傳結(jié)構(gòu)分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度值應(yīng)介于0.5～0.7。多態(tài)信息含量是表示微衛(wèi)星座位多態(tài)性高低的一個指標(biāo)。當(dāng)微衛(wèi)星座位PIC＞0.5時，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態(tài)性座位;當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時，表明該遺傳標(biāo)記能夠較為合理的提供遺傳信息，為中度多態(tài)性座位;當(dāng)PIC＜0.25時，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差，為低度多態(tài)性座位。本研究中，A種群豚鼠在12個位點上呈高度多態(tài)性，在8個位點上呈中度多態(tài)性，在5個位點上呈低度多態(tài)性，平均多態(tài)信息含量為0.459，為中度多態(tài)性種群;B群豚鼠在12個位點上呈高度多態(tài)性，在12個位點上呈中度多態(tài)性，在1個位點上呈低度多態(tài)性，平均多態(tài)信息含量為0.518，屬于高度多態(tài)性種群。通過以上數(shù)據(jù)可以看出B群豚鼠多樣性略高，這與理論相符，可能與A種群豚鼠引種較早，并且群體不夠大有關(guān)。A群豚鼠自1994年引種至今已有20年，其雜合度變化可能有以下4種原因:(1)管理失誤:飼養(yǎng)管理不當(dāng)、缺乏專業(yè)人員的監(jiān)督和管理等人為失誤是引起群體遺傳特性改變的一個因素;(2)引入其他種群動物:封閉群動物的繁育采用封閉的方式，引入其他種群動物，也會引起遺傳組成發(fā)生變化;(3)繁殖交配方式改變:封閉群動物的繁育中應(yīng)避免近親交配的出現(xiàn)，可通過最大避免近親法、循環(huán)交配法或數(shù)量足夠大時用隨機(jī)交配法以避免近親交配;(4)群體大小:為保持封閉群動物的遺傳異質(zhì)性，引種動物的數(shù)量要足夠多，小型嚙齒類封閉群動物引種數(shù)目一般不能少于25對。根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果，A種群豚鼠在5個位點顯著偏離遺傳平衡，B種群豚鼠在6個位點顯著偏離遺傳平衡，并且兩個種群偏離平衡的位點，大多表現(xiàn)為雜合子缺陷。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是在飼養(yǎng)繁殖過程中未能實現(xiàn)隨機(jī)交配，近交程度有所升高導(dǎo)致的。實驗動物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現(xiàn)象似乎是其繁殖過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一個問題。目前由于封閉群動物普遍缺乏相應(yīng)的遺傳監(jiān)測，因此在繁育過程中要遵守嚴(yán)格的操作程序以避免近交現(xiàn)象，同時，通過定期的遺傳檢測對其生產(chǎn)管理及繁殖方式等作出評估及調(diào)整是必需的。

3.2兩個封閉群豚鼠遺傳關(guān)系Fst是種群之間遺傳差異的一種測度。F-統(tǒng)計量計算結(jié)果表明，兩個種群在25個微衛(wèi)星位點的平均Fst為0.1056，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的10.56%，89.44%的遺傳變異來自群體內(nèi)部的遺傳多樣性。依據(jù)遺傳分化指數(shù)Fst的解釋(介于0－0.05之間說明種群間分化很弱，0.05－0.15之間表示中等分化，0.15～0.25之間表示分化大，大于0.25表明分化極大)，說明兩群體間的遺傳分化已達(dá)到中等水平。遺傳距離以兩個群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數(shù)來測定，被用以描述群體的遺傳結(jié)構(gòu)和品種間的差異。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204，說明兩群體間的親緣關(guān)系較近。本研究利用25個微衛(wèi)星標(biāo)記對兩個種群封閉群豚鼠的遺傳檢測表明，兩個種群均符合封閉群動物的群體遺傳特征，遺傳分化處于中等水平，B種群的多樣性略高于A種群。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果提示種群的繁殖過程中有不同程度的近交現(xiàn)象存在。本研究結(jié)果可為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)資料。

作者：李芳芳魏杰王洪岳秉飛單位：中國食品藥品檢定研究院