小動物內鏡在體成像應用探討范文

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摘要：目的目前小鼠腸道病變監測需處死小鼠取病變組織。本文的研究目的是探索一種安全有效的方法，即構建小動物成像平臺，來實現對腸道病變的在體監測，實現對同一小鼠的縱向研究。方法根據電子內鏡成像原理搭建小動物成像平臺。選取6只Balb‐c小鼠分別給予3%葡聚糖硫酸鈉或生理鹽水自由飲用，監測小鼠生理狀況并利用內鏡系統觀察腸道黏膜損傷。結果所有小鼠均在麻醉狀態下進行內鏡檢查，進境深度可達3cm，且無內鏡相關并發癥發生。內鏡下可見葡聚糖硫酸鈉組小鼠腸道病變逐漸加重。結論小動物結腸內窺鏡可對腸道黏膜進行清晰成像，實現病變的在體評估，此外還可用于對其他干預措施的療效監測。

關鍵詞：小動物結腸鏡；潰瘍性結腸炎；葡聚糖硫酸鈉；小鼠動物模型

人體內窺鏡檢查是醫生檢查腸道炎癥或腫瘤變化的有效方法。在醫學和免疫學研究中，腸道疾病的動物模型在臨床前研究中扮演重要角色，成為研究腸道粘膜免疫系統、結腸炎和癌癥發展的關鍵工具。但由于動物體積較小，很難對其實現準確評估。如潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)，一種主要局限于大腸黏膜和黏膜下層的慢性復發性非特異性腸道炎癥性疾病，目前對模型的有效評估仍依賴于疾病活動指數（DAI）評估和體外組織病理學監測。DAI評分主要通過對小鼠的體重，大便性狀和隱血情況的觀察進行評分，在一定程度上受主觀性影響；病理學監測均需處死小鼠取相應組織進行離體分析。故該方法存在以下缺陷：①無法實現病變的縱向觀察，實現在體動態監測，缺乏可重復性；②主觀個體差異及鼠間差異性影響結果準確性；③增加了研究的成本。此外化學誘導結腸癌模型（如偶氮氧甲烷(azoxymethane,AOM)和1,2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)在結直腸癌研究中得到廣泛應用[1]，用于早期致癌事件和評估潛在治療方法的研究，但模型構建周期長達30周，優化后通過致癌藥物聯用（如AOM/DSS，AOM/DMH），雖然縮短了誘導時間，但至少也需要10周[2]。長時間的誘導及小鼠個體差異，很難在體確定每只小鼠腫瘤數量和生長動力學的相關問題。雖然目前已有用于小鼠的無創成像技術，如正電子發射斷層掃描和磁共振成像[3]，它們使研究者能夠在腫瘤研究的每個所需時間點進行實時觀察。然而，這些方法成本高、耗時，并且僅能提供不精確的腸道視圖。本文的研究目的是為了尋找一種安全、經濟、有效的方法，用于對小鼠腸道進行清晰成像，動態監測腸道病變，實現對小鼠的縱向研究。該成像技術應具有安全性，可行性和可重復性等特點。故本課題組自行組裝軟式小動物結腸內窺鏡，并對該設備在小鼠模型中的應用進行探索研究。

1材料和方法

1.1材料

Balb‐cnu/nu小鼠（6‐8周，體重約18‐20g），購于維通利華實驗動物中心；葡聚糖硫酸鈉（分子量36000‐50000），購自華美試劑公司，配置為3%水溶液；麻醉劑（5%氯胺酮+1%甲苯噻嗪）。

1.2設備構建

依據電子內鏡成像原理利用光源、信息處理器（主機）、視頻顯示系統（圖像采集）、內鏡、輔助配件五部分搭建小動物內窺鏡成像系統。

1.3方法

1.3.1潰瘍性結腸炎模型構建

取6只小鼠，進行編號后，采用隨機數字表法將其隨機分為對照組和實驗組。實驗組自由飲用3%DSS水溶液，對照組給予蒸餾水飲用，連續飲用15d。

1.3.2內鏡下監測

內鏡操作前對成像探頭進行水潤滑，小鼠進行麻醉，麻醉劑使用方法為氯胺酮100mg/kg+甲苯噻嗪10mg/kg腹腔注射。待小鼠麻醉后，進行進境操作，平均進境深度約3cm。根據UCEIS[4]評分標準進行內鏡下評分，包括血管模式（血管分布正常1分；血管結構模糊2分；血管閉塞或消失3分）、出血情況（無出血1分；可見陳舊性出血，用水沖洗后無血跡2分；可見血跡，用水沖洗后可見滲血3分；活動性出血4分）、糜爛和潰瘍（黏膜正常1分；黏膜粗糙、糜爛2分；可見淺表性潰瘍，表面覆白苔3分；可見潰瘍，且深度較深4分）。實驗結束后，處死小鼠，取遠端結腸組織行病理學檢查。根據Dieleman評分標準[5]進行組織病理學評分，評分標準見表1。

1.3.3數據分析

利用SPSS15.0軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。

2研究結果

2.1設備示意圖

小動物內窺成像設備示意圖，該系統主要依賴于鏡身前端裝備的成像設備進行圖像采集，經圖像傳感器將光學信號轉換為電子信號，后經圖像處理器對信息進行處理后顯示在監視器的屏幕上。成像探頭外直徑1.9cm，成像前端角度可自由調節。

2.2內鏡及病理學評估：內鏡下動態觀察小鼠腸壁黏膜變化。對正常腸壁黏膜組織進行內鏡下觀察可見明顯的血管分布和走行（圖2A）。第7天，血管走行紊亂，黏膜發紅，粗糙呈顆粒狀，肛門處病變最明顯（圖3B）。第10天，腸壁黏膜血管走行模糊、紊亂，多處可見血跡，局部黏膜有壞死。造模第15天，腸壁黏膜脫落且部分腸壁附著有膿性分泌物（圖2D）。15天后處死小鼠，取遠端結腸組織行HE染色，3A、3B為小鼠腸道離體組織。病理結果顯示正常結腸組織HE染色，可見結腸黏膜上皮組織完整，結構清晰，上皮細胞排列整齊，腺體完整。DSS組可見黏膜廣泛缺失，腺體多數不完整，隱窩急性炎細胞浸潤，呈典型炎癥改變，黏膜表層糜爛，可見潰瘍形成（圖3D）。對腸道病變分別進行內鏡下及病理學評分，結果均顯示隨著DSS飲用時間的延長評分逐漸增高，內鏡下評分與組織病理學評分結果具有一致性。

3討論

在臨床應用中，內鏡下監測聯合病理學檢查可實現對患者腸道病變情況進行在體評估。但對于研究動物而言，雖然目前動物腸道炎癥及腫瘤模型構建方法存在多種，如化學藥物誘導型、基因型、細胞移植型、自發性動物模型[6-8]。但由于小鼠體積較小，對腸道病變進行有效評估的唯一方法即處死小鼠取病變組織進行病理學分析。因此，適用于小動物水平的內鏡系統的研發對動物水平在體研究具有重要意義。國外已有研究者對可用于小動物在體成像的內鏡設備進行了研究，實現了動物水平腸道內窺成像，但國內仍缺少相關領域的研究。故本課題組根據內鏡成像原理，自行搭建小動物成像平臺，并對其應用進行了探索研究。潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)具有癌變傾向，且該病發病率和患病率在我國有明顯增加趨勢[9-11]。本研究通過自由飲用3%DSS構建腸道炎癥模型，通過小動物結腸內窺鏡系統對小鼠腸道進行縱向觀察，研究結果表明該內鏡系統不僅可實現腸道黏膜進行清晰成像，對小鼠腸道黏膜病變進行縱向觀察，完成UCEIS評分，而且可以在可視情況下進行重復性操作。與傳統評價疾病活動程度或腫瘤生長情況的方法相比（如體重、血便、血液分析、處死后離體組織學分析）具有明顯的優勢。首先，縱向觀察很好的形成自身對照，減少了鼠間個體差異，同時也有利于選擇最佳個體，進行更好的動物實驗研究。此外，可有效降低研究成本。最重要的是，可依據內鏡評價標準對腸道病變內鏡下成像進行客觀評價。與現有的其他應用于小動物的成像設備相比具有以下優勢：（1）多數研究[12-13]使用的均為硬式內鏡，存在進境距離受限及操作難度高等缺陷，該系統采用軟式內鏡成像探頭，與現有的硬式內鏡相比，能有效調節進鏡角度和距離，增加進鏡深度，降低操作并發癥的發生；（2）活檢探頭直徑小，可對小鼠進行多種操作，如腸道疾病的縱向動態監測、經腹進行腹腔操作如觀察腹腔內器官病變情況、肝腫瘤模型構建等；（3）研究與輔助通道配套的相關零件設備后，可通過輔助通道實現腸道腸道內給藥、在體活檢等多種操作。隨著成像技術的發展，多模態成像成為重要的發展方向之一。MitsunagaM[14]應用的設備可結合熒光探針進行熒光成像，提高病變的檢出率。ShaoP[15]將高分辨顯微內鏡（high-resolutionfiber-opticmicroendoscopy，HRME）成像技術與基于光纖的光聲內鏡（fiber-based,real-timeC-scanoptical-resolutionphotoacousticmicroscopy，F-OR-PAM）結合構建新型內鏡成像系統對小鼠耳部血管和人口腔黏膜同時進行熒光成像和光聲成像，用于檢測毛細血管結構及組織細胞。多種成像模式的結合，具有提高成像效果的作用。因此該設備仍存在成像模式單一的缺點，在未來還有待進一步的優化。

作者：張娜1；高健翎2；屈亞威2；賈馥華2；劉海峰2 單位：1.安徽醫科大學武警總醫院臨床學院，2.武警總醫院消化內科，北京