木霉菌分生孢子水分散粒劑的研制范文

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《農藥雜志》2015年第七期

近年來隨著各國政府和民眾對環境保護和食品安全的日益關注，化學農藥已受到了極大的限制。微生物農藥因其無公害、無污染、無殘留且有害生物對其不易產生抗藥性等特點，已在研發和應用上獲得了長足的發展。在我國，以B.t.殺蟲蛋白、井岡霉素和阿維菌素為主的各類微生物農藥施用面積已占病蟲害防治總面積的15%以上。云南農業大學和中國農業大學共同研制的枯草芽孢桿菌B908“白抗”可濕性粉劑能夠有效的防治番茄灰霉病、西瓜枯萎病，具有商業化潛力。華東理工大學和上海澤元海洋生物技術有限公司合作，成功的開發出了多粘類芽孢桿菌0.1億cfu/g顆粒劑，同時還在進行10億cfu/g可濕性粉劑的放大生產可行性研究。這些商品的應用，不僅緩解了當今由化學農藥所造成的環境污染問題，同時也幫助農民得到了更多的實惠，使微生物農藥成為當今農藥發展的熱點。國內、外科研人員對木霉菌生物制劑在作物病害防治上的應用已做了大量的工作，但產品的種類僅限于粉劑、可濕性粉劑和顆粒劑。國際上已經商品化的活菌水分散顆粒劑多見于細菌產品，美國開發的B.t.鲇澤亞種水分散性顆粒劑，具有貯運方便、穩定性高、污染少等優點。然而，有關木霉菌水分散顆粒劑開發的報道還不多見，特別是木霉菌孢子在產品加工過程中對脫水的耐性，以及產品制作過程中的工藝條件對成品貨架期的影響等方面，仍需進行更深入的研究。本實驗通過對不同的填料和助劑的篩選，以及對加工過程中的溫度和成品的含水量對木霉菌分生孢子貨架期影響等方面的測定，為開發高質量的木霉菌水分散粒劑，提供了可參考的依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1Tr309T分生孢子原粉的生產本實驗所用的木霉菌株Tr309T是上海萬力華生物科技有限公司從采集的土壤樣品中分離得到的，經鑒定為綠色木霉菌(Trichodermaviride)。將Tr309T接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板上培養96h，用無菌接種針刮平板上的分生孢子并將孢子轉移到含有500mL葡萄糖馬鈴薯培養液(PDB)的三角瓶中。再通過血球計數板和無菌蒸餾水，將孢子液的含量定容到1×107個孢子/mL，放置在28℃、200r/min的搖床上培養168h，再通過離心(2500r/min，離心15min)，在35℃溫度條件下，自然干燥15h，得到Tr309T孢子原粉，其孢子含量為2×109個/g，含水量7%，細度過44μm的標準篩，外觀為深綠色粉末。

1.1.2填料與助劑填料：硅藻土A(20μm)，硅藻土B(15μm，白色)，膨潤土(20μm，灰白色)，石家莊長利礦石有限公司；滑石粉(20μm，白色，創宇化工有限公司)；高嶺土(20μm，白色，靈壽蘭祥礦石產品有限公司)。助劑：葡萄糖、麥芽糊精、聚乙烯醇、甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉(SDS)、木質素磺酸鈉、2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽(NNO)、氯化鈉、硫酸銨、尿素，均為化學純，上海潤捷化學試劑有限公司；拉開粉(BX)，工業級，上虞浙創化工有限公司。

1.1.3主要儀器與設備閃蒸干燥(常州豪順干燥設備有限公司XG-00)，恒溫干燥箱(上海一恒科技有限公司DHG9055A)，擠壓造粒機(張家港開創機械設備有限公司ZLB-80)，水分測定儀(杭州科旭儀器有限公司OHAUSMB-35)，分析天平(杭州科旭儀器有限公司OHAUSCP64)，旋轉蒸發儀(上海予華儀器有限公司NE6000)。1.1.4培養基TSM培養基：MgSO4•7H2O0.2g/L、KH2PO40.9g/L、KCl0.15g/L、NH4NO31.0g/L、葡萄糖3g/L、氯霉素0.25g/L、甲基磺0.3g/L、五氯硝基苯0.2g/L，玫瑰紅0.15g/L、瓊脂20g/L。

1.2實驗方法

1.2.1制劑中木霉菌分生孢子含量的測定按TSM平板菌落計數法，分別取1g樣品，加入含有9mL0.1%吐溫-80的無菌水試管中，在渦旋振蕩器上震蕩均勻，用移液器從試管中部吸取孢子懸浮液1mL轉移到下一個試管中，依次稀釋并配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9孢子懸液。用移液器分別從不同梯度的試管中吸取并轉移1mL孢子懸液到培養基平板上，用曲玻棒涂布均勻。每個處理重復3次。將平板放入25℃的培養箱培養72h，統計平板木霉菌菌落數，根據稀釋倍數計算樣品中木霉菌分生孢子的濃度(cfu/g)。

1.2.2木霉菌樣品水分的測定方法使用MB-35水分測定儀，設置烘干溫度100℃，放入0.500g樣品進行測定，每份樣品有做4個平行，記錄數據。

1.2.3填料、助劑與木霉菌相容性測定填料(硅藻土、滑石粉、高嶺土、膨潤土)分別以100、250、500g/L的質量濃度與PDA培養基混合搖勻后，潤濕分散劑(十二烷基硫酸鈉、木質素磺酸鈉、2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽、拉開粉)、崩解劑(氯化鈉、硫酸鈉、尿素)分別以5、10、50g/L的質量濃度與PDA培養基混合搖勻后，121℃滅菌20min，冷卻至60℃后倒入培養皿，用不含填料或助劑的PDA培養皿作為空白對照。用滅菌打孔器取直徑為2.5mm的Tr309T的菌塊，接種到上述不同處理的PDA平板的中心，每個處理有3個平行，在28℃下避光的培養箱中培養48h后測量菌落直徑，取平均值，并按以下公式計算菌落生長抑制率。菌落的生長抑制率(%)=[空白對照PDA的菌落直徑-加有填料(助劑)PDA上的菌落直徑]/空白對照PDA的菌落直徑。

1.2.4填料、助劑最佳混合濃度篩選實驗根據以上對填料和助劑與木霉菌相容性的篩選結果和使用質量濃度范圍，選出相容性較好的潤濕分散劑、崩解劑、黏結劑。通過4因素3水平的正交試驗，篩選填料、助劑最佳混合濃度的添加配比，具體操作方案與結果見表3。

1.2.5懸浮率的測定根據GB/T14825農藥可濕性粉劑懸浮率測定方法，稱取樣品1g，倒入含250mL水的量筒中，蓋上塞子，以量筒中部為軸心，將量筒上下顛倒30次/min，打開塞子，靜置30min后，在10~15s內用吸管將225mL懸浮液移出。測定留在量筒底部的25mL懸浮液中的孢子量。

1.2.6潤濕時間的測定根據GB/T5451—2001農藥可濕性粉劑潤濕時間測定方法，取(100±1)mL標準硬水，注入250mL燒杯中，稱取(5±0.1)g的試樣，置于表面皿上，將全部試樣從與燒杯口齊平的位置一次性均勻地傾倒在該燒杯的液面上，但不要過分地擾動液面。加試樣時立即用秒表記時，直至試樣全部潤濕為止。記下潤濕時間(精確至秒)。如此重復5次，取其平均值，作為該樣品的潤濕時間。

1.2.7崩解時間的測定用100mL的錐形量筒裝入98mL的水，然后放入1g的樣品，把口封住，以量筒的中間部位為中軸，以8r/min的速度進行旋轉，同時開始記錄時間，直到無可見顆粒時為止，即為崩解時間。

1.2.8制劑中分生孢子萌發率的測定根據1.2.1的檢測方法進行檢測，統計平板木霉菌菌落數，計算萌發的孢子量。同時用血球計數器對稀釋為10-3孢子懸液進行鏡檢計數，重復取樣3次，取其平均值，按照以下公式計算分生孢子萌發率。萌發率(%)=平板分生孢子計數量/鏡檢分生孢子計數量×100

1.2.9制劑生產過程的工藝優化本試驗的造粒操作是采用開創ZLB-80型擠出式造粒機。將各助劑稱量好。細度達到44μm以上，將原粉加入黏結劑水溶液混勻后，在加入助劑、載體補足100%，攪拌混勻捏合至可塑形狀后，選擇0.8mm孔徑網篩，擠出造粒，在35℃烘干室內烘至6%含水量，得到木霉菌Tr309T水分散粒劑產品。

1.2.10不同干燥溫度對木霉菌分生孢子萌發率的影響優化將所得的木霉菌水分散粒劑取樣15次，分別稱取15~20g樣品(精確到0.002g)，緩慢加入到予華NE6000-2旋轉蒸發儀的旋蒸瓶中，水浴鍋的溫度依次設定為30、35、40、45、50℃。將旋蒸瓶的轉速設定為40r/min，真空泵的真空度調節為-0.1MPa并穩定。將樣品水分蒸發至6%時，取出樣品，并分裝于安瓿瓶中，放置于恒溫25℃貯存。每隔1個月跟蹤檢測木霉菌孢子的萌發率(檢測方法見1.2.6)。

1.2.11不同最終含水量對木霉菌孢子萌發率影響優化將所得的木霉菌水分散粒劑取樣15次，分別稱取15~20g樣品(精確到0.002g)，緩慢加入到旋轉蒸發儀的旋蒸瓶中，水浴鍋的溫度控制為最佳真空干燥溫度，將旋蒸瓶的轉速設定為40r/min，真空泵的真空度調節為-0.1MPa并穩定。將樣品水分依次蒸發至2%、4%、6%、8%、10%時，取出樣品分裝于安瓿瓶中，放置于恒溫25℃貯存。每隔1個月跟蹤檢測木霉菌孢子的萌發率(檢測方法見1.2.8)。

1.2.12數據分析所有試驗均重復3次，計算平均值(n=3)，將所得相關試驗數據用SPSS17.0版本軟件對其進行ANOVA統計分析。

2結果與分析

2.1不同填料與木霉菌株Tr309T的相容性測定不同填料與木霉菌株Tr309T的相容性測試結果(見表1)顯示，硅藻土A和B與木霉菌株Tr309T的相容性較其他填料與Tr309T的相容性高。在使用量為100g/L和250g/L時，硅藻土A和B對Tr309T的生長抑制率都為0%，在使用量達500g/L時，對Tr309T的生長抑制率僅分別為17.1%和5.4%，顯著低于(P≤0.05)滑石粉、膨潤土和高嶺土對Tr309T的生長抑制率(分別為35.8%、88.2%和27.6%)，雖然當使用量為100g/L和250g/L時，滑石粉和高嶺土對Tr309T的生長抑制率僅分別為0%和2.7%以及0%和8.6%，顯著低于(P≤0.05)膨潤土對Tr309T的生長抑制率(分別為3.2%和33.2%)。

2.2不同助劑與木霉菌分生孢子相容性測定結果當助劑使用量達到50g/L時，十二烷基硫酸鈉、拉開粉對木霉菌分生孢子的抑制率達到100%，顯著高于NNO對分生孢子的抑制率(28%)。因此確認NNO為Tr309T水分散粒劑的潤濕分散劑，使用量為5%~10%。當崩解劑的使用質量濃度為5g/L時，各崩解劑對Tr309T均無明顯的抑制效果，而質量濃度達到50g/L時，尿素、硫酸銨對Tr309T抑制效果顯(分別為38%、22.7%)著高于氯化鈉(19.8%)對Tr309T抑制效果，因此選用氯化鈉作為崩解劑且使用量為5%~10%。當黏結劑的使用濃度為5g/L時，各黏結劑對Tr309T均無明顯的抑制效果，而質量濃度達到50g/L時，淀粉、葡萄糖、糊精對Tr309T抑制效果(分別為31.5%、32.5%、29.3%)顯著高于甲基纖維素(7.5%)對Tr309T抑制效果，因此選用甲基纖維素為崩解劑且使用量為10%~15%。

3制劑生產過程中的工藝優化結果

3.1填料、助劑最佳混合濃度配方篩選根據L9(34)正交試驗的極差分析，針對潤濕時間，極差值顯示RB＞RA＞RC，說明潤濕分散劑對潤濕時間的影響是最大的；針對懸浮率，極差值顯示RB＞RA＞RC，說明潤濕分散劑對懸浮率的影響也是最大的；針對崩解時間，極差值顯示RC＞RA＞RB，說明崩解劑對崩解時間的影響是最大的。根據各指標的實驗結果，確定各因素的最優水平組合：對于潤濕時間，最優組合是A1B3C3；對于懸浮率的最優組合是A2B3C3；對于崩解時間，最優組合是A1B2(B3)C3。黏結劑含量選擇A2時，懸浮率比黏結劑含量選擇A1時高了8.3%，崩解時間快了2.7s。因此根據綜合平衡法，最終確定水分散粒劑的填料、助劑最佳混合濃度配方為A2B3C3(見表3)。

3.2制劑生產過程中的工藝優化

3.2.1干燥溫度對木霉菌孢子萌發率影響的優化根據實驗要求，定期對不同溫度烘干的制劑樣品，進行木霉菌分生孢子存活率與后期萌發率跟蹤檢測(見圖1、2)。對不同烘干溫度所得的Tr309T水分散粒劑進行檢測，30、35℃的初始存活率在95%以上，40、45℃的初始存活率在90%，而50℃的初始存活率僅80%。對Tr309T水分散粒劑在40、45、50℃的溫度下烘干并存儲9個月后，分生孢子的萌發率近于0%。然而經30℃和35℃烘干處理并6個月后，制劑中分生孢子的萌發率分別為56%和81%，直到存儲至11個月后，萌發率為0%。

3.2.2制劑最終含水量對木霉菌孢子萌發率影響的優化根據以上干燥實驗結果，選擇出最佳的烘干溫度(35℃)，用此溫度，將樣品水分依次烘干到2%~10%，并定期對制劑樣品進行木霉菌分生孢子萌發率跟蹤檢測(見圖3)。從圖中可以觀察到，當最終含水量為2%時，在初期檢測時Tr309T水分散粒劑的顆粒的萌發率也只有68%左右，而含水量在8%、10%，分別在第3、5個月檢測時，檢測平板已經出現了染菌現象。而水分維持在6%時，在6個月內萌發率均達到80%以上。根據最佳配方的配比，按照調整的生產工藝路線，得到Tr309T水分散粒劑。根據各項質量檢測的方法，得到Tr309T水分散粒劑的孢子含量為2.03×108，水分含量為6.03%，懸浮率為78.6%，潤濕時間為46.7s，崩解時間為55.7s。

4討論與分析

水分散粒劑是一種比可濕性粉劑更安全更適用的新劑型。研究和開發水分散粒劑，完全順應了微生物農藥劑型加工逐漸從液體制劑向固體制劑，從粉末制劑向顆粒狀制劑方向發展的趨勢。湯堅等[13]研究了15種不同的載體對球孢白僵菌孢子粉孢子的萌發率、產孢量和菌落生長速度的影響，從中篩選出了高嶺土、滑石粉、硅藻土等一些惰性礦物質材料可作為白僵菌制劑的載體，但是不同的惰性物質對木霉菌的活力影響不盡相同。本文將菌株Tr309T分別與不同的填料載體進行相容性測試，選擇了相容效果較佳的硅藻土B作為載體。因為硅藻土對木霉菌分生孢子萌發的影響較小，適用于木霉菌水分散粒劑。張擁華等研究中發現木質素磺酸鈣對粘帚菌孢子活力無明顯影響。Jin等在優化白僵菌非離子表面活性劑時設計了表面活性劑的添加對白僵菌萌發影響的研究，選擇對白僵菌萌發影響小的表面活性劑類型?；铙w微生物農藥助劑的選擇要謹慎，需要增加其他實驗來確定助劑自身對活體有效成分是否存在影響。楊合同在其研制的木霉制劑中添加十二烷基硫酸鈉作為潤濕分散劑。本研究中發現，當十二烷基硫酸鈉的添加質量濃度僅為5g/L時，對Tr309T分生孢子的萌發抑制率可達84%以上，而在此濃度下使用2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽，對Tr309T分生孢子的萌發抑制率僅為7%左右。因此，在制作木霉菌水分散粒劑時，2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽是一種較適合使用的潤濕分散劑。Sargin等對哈茨木霉菌EGE-K38固體發酵生產的分生孢子進行的干燥溫度測試，在40℃烘干24h，孢子產量最高。Jin等對哈茨木霉菌進行微膠囊化處理時，噴霧干燥設備最佳的進/出口溫度設定為60/31℃。這說明在不同的烘干溫度下，木霉菌分生孢子對溫度的耐受力時間不同，并隨著烘干溫度的升高，分生孢子對此溫度的耐受時間就會相應的降低。本文作者據此對Tr309T水分散粒劑的烘干溫度與終含水量進行了梯度處理，最終選擇出對Tr309T水分散粒劑的分生孢子的最佳烘干溫度為35℃和制劑終含水量為6%。

木霉菌對外界環境條件的變化很敏感，造成了木霉菌制劑貯存期穩定性差和貨架期短等問題。SARGIN等發現在噴霧干燥過程中使用甘油作為哈茨木霉菌分生孢子的微膠囊化保護劑，可以有效的延長干燥和貯存過程中分生孢子的存活率。在開發木霉菌生物制劑的過程中，對制劑配方材料的篩選、生產成本的控制以及如何保持木霉菌孢子的貨架期，都是必需考慮和解決的問題。本文在選用合適的填料和不同功能的助劑，制劑加工過程中干燥溫度和成品制劑的含水量以及制劑中活體有效成分貨架期所做的測試及對制劑配方的篩選和生產工藝的優化有至關重要的作用。使制備的Tr309T水分散粒劑中分生孢子的存貯時間得到延長，為木霉菌水分散粒劑的開發提供了可參考的實驗依據和思路。

作者：謝俊 曠文豐 陳娟 毛偉力 單位：海萬力華生物科技有限公司