轉(zhuǎn)CaM基因提高棉花抗寒性范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了轉(zhuǎn)CaM基因提高棉花抗寒性參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《棉花學(xué)報》2016年第三期

摘要：

為了獲得耐低溫棉花新材料，通過花粉管通道法獲得了轉(zhuǎn)cam基因棉花，經(jīng)過分子檢測得到了3個轉(zhuǎn)基因株系。同時對得到的轉(zhuǎn)基因株系的T4代（C1、C2、C3）和棉花受體（CK）在低溫處理后的相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行了初步測定。發(fā)現(xiàn)在低溫（4℃）處理24h后，C1、C2、C3葉片中的丙二醛（MDA）含量明顯低于對照，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活力、可溶性糖的含量明顯高于對照，而常溫下（23℃）測定值沒有明顯的差異。表明轉(zhuǎn)CaM基因棉花在低溫時能夠通過減輕葉片膜脂過氧化程度，提高抗氧化酶活力等反應(yīng)來緩解低溫對棉花葉片的損傷。本研究篩選出了3個具有一定抗寒能力的轉(zhuǎn)基因株系，為下一步選育抗寒新品種奠定了基礎(chǔ)，也為其他棉花抗寒轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：

棉花；CaM基因；低溫脅迫；生理特性；膜脂過氧化；抗氧化酶；抗寒性

低溫傷害是影響北方春播作物生產(chǎn)的重要因素之一。河北省東北部和新疆部分地區(qū)棉田經(jīng)常會受到倒春寒不同程度的影響，不僅影響了棉花的生長發(fā)育而且會增加生產(chǎn)成本。因此，研究和創(chuàng)制耐低溫的棉花新材料對棉花的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要意義。植物的耐低溫性受多基因控制，并與其生理狀態(tài)（植株含水量、發(fā)育時期、營養(yǎng)狀況等）發(fā)生交互作用，因而利用傳統(tǒng)的遺傳改良方法提高植物低溫耐性受到較大制約。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物抗寒性成為新的技術(shù)手段。目前，已有許多關(guān)于轉(zhuǎn)耐低溫基因的研究，如劉榮梅等[1]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥轉(zhuǎn)錄因子CBF3基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得有一定抗寒性的煙草植株；Artus等[2]研究了擬南芥中耐低溫基因COR15a的表達(dá)，吳純清等[3]將CBF3和COR15a雙價基因轉(zhuǎn)入煙草來改善煙草抗寒性。此外，還有研究將昆蟲的抗凍蛋白基因Mpafp149轉(zhuǎn)入煙草[4]，CBF4基因轉(zhuǎn)入擬南芥[5]，美洲擬鰈抗凍蛋白基因（afp）導(dǎo)入番茄[6]，CBF1基因轉(zhuǎn)入水稻[7]等。用于棉花抗寒性改良的耐低溫基因有betA[8]、Mpafp149[9]、PEBP[10]等。一般認(rèn)為鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是一種在生物中廣泛分布，以Ca2+受體形式參與細(xì)胞中多種酶及眾多鈣依賴性生理調(diào)節(jié)過程，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化等極為重要的多功能蛋白。Ca2+在植物低溫脅迫響應(yīng)中可能主要起2方面的作用：一是通過穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定一些重要蛋白質(zhì)構(gòu)象，提高某些保護(hù)酶的活性以增強(qiáng)植物的抗寒能力，二是Ca2+在植物對各種外界刺激產(chǎn)生特定生理反應(yīng)中充當(dāng)胞內(nèi)信使，誘導(dǎo)抗凍基因的表達(dá)從而提高植物的抗凍力[11]。本研究將石斑魚（Epinepheluscoioides）鈣調(diào)蛋白基因CaM改造并轉(zhuǎn)化棉花受體，通過篩選陽性植株，初步分析轉(zhuǎn)基因株系在低溫處理后主要生理指標(biāo)的變化，為下一步選育抗寒棉花新品種奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗材料石斑魚鈣調(diào)蛋白基因CaM（GenBank：KC540636），ORF（Openreadingframe）長度為450bp，編碼149個氨基酸殘基，2個Ca2+活性結(jié)合域。棉花受體為常規(guī)陸地棉品系08N109。

1.2CaM表達(dá)載體構(gòu)建利用[12-13]對石斑魚鈣調(diào)蛋白基因CaM編碼蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合位點預(yù)測，在保留功能基團(tuán)的基礎(chǔ)上對其cDNA.列堿基剪切編輯。改造后的cDNA序列委托上海生物工程公司人工合成，并插入pEGM-T克隆載體，用XbaⅠ和SacⅠ酶切，同時與雙酶切載體pBI121連接，獲得表達(dá)載體pBI121-CaM，圖1為載體構(gòu)建流程圖。

1.3花粉管導(dǎo)入外源CaM采用堿裂解法提取CaM菌液中的質(zhì)粒DNA。將純化后的質(zhì)粒DNA溶于pH7.6的TE緩沖液中，測得A260/A280為1.95。于2012年7月在棉花自交授粉當(dāng)天下午16:00左右用50μL微量注射器將10～12μL含目的基因CaM的質(zhì)粒溶液注入子房中，含CaM的質(zhì)粒溶液的質(zhì)量濃度為20ng•μL－1，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，待種子成熟后收集各株棉花的種子，播種得到T0轉(zhuǎn)化株系。將獲得的新個體（T0）自交獲得T1植株，繼續(xù)自交可獲得轉(zhuǎn)基因植株的T2、T3、T4，用于后續(xù)研究。

1.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測及測序采取各代轉(zhuǎn)化植株頂端新生葉片，用改良的CTAB法提取轉(zhuǎn)化植株T0、T1、T2、T3和對照植株基因組DNA[14]，以含有CaM基因的質(zhì)粒DNA為陽性對照。以基因組DNA為模板，采取CaM基因的正反引物進(jìn)行PCR檢測。上游引物：5'-ATGGCTGATCAGCTTACAGA-3'；下游引物：5'-TCAAAAGACACGGAATGC-3'。PCR檢測配備25μL反應(yīng)體系：Mix12.5μL，PrimerF1.0μL，PrimerR1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O9.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min，進(jìn)入40個循環(huán)（94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s），72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海Invitro-gen公司測序，重復(fù)3次，測序結(jié)果用DNAMAN軟件拼接、比對。

1.5轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測通過CTAB-皂土法提取轉(zhuǎn)基因受體材料及T0轉(zhuǎn)基因植株基因組RNA[15]，采用瓊脂糖電泳檢測其完整性及純度。將受體植株和初步挑選出的陽性植株的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.6轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力測定抗寒能力測定是在T4棉花四葉期對對照及陽性植株進(jìn)行抗寒初步鑒定。將檢測結(jié)果為陽性的3個植株（C1、C2、C3）自交獲得的T4種子與受體植株自交后得到的種子種植在蛭石上培養(yǎng)成為幼苗，選擇長勢相近的苗進(jìn)行試驗。轉(zhuǎn)基因幼苗四葉期時從23℃的培養(yǎng)室轉(zhuǎn)入10℃緩沖間煉苗14h，然后轉(zhuǎn)入4℃的空間內(nèi)處理24h，采取各植株同一位置的葉片測定其丙二醛（Malon-dialdehyde，MDA）、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxide，POD）活力等指標(biāo)，每個株系設(shè)置3次重復(fù)。指標(biāo)的測定參照高俊鳳[16]的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》中的方法進(jìn)行。于上述抗寒指標(biāo)測定取樣后，將幼苗移入10℃緩沖間放置14h，之后轉(zhuǎn)入23℃的培養(yǎng)室培養(yǎng)，觀察低溫處理后幼苗的恢復(fù)情況。采用MicrosoftExcel2007繪圖及DPS7.05統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并對指標(biāo)差異顯著性采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1CaM基因的改造與表達(dá)載體

2.1.1CaM基因的改造及預(yù)測的蛋白構(gòu)象。本研究將450bp的石斑魚鈣調(diào)蛋白基因CaM改造為282bp，編碼93個氨基酸殘基，保留了2個Ca2+活性結(jié)合域。目的基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列見圖2。通過RecognitionEngineV2.0軟件預(yù)測鈣調(diào)蛋白三級結(jié)構(gòu)見圖3，其具有EF-hand結(jié)構(gòu)域，能夠與Ca2+結(jié)合來調(diào)節(jié)多種代謝過程。

2.1.2目的基因的表達(dá)。在表達(dá)目的基因的植物表達(dá)載體中，目的基因由花椰菜花葉病毒35S啟動子驅(qū)動，胭脂堿合酶（NOS）終止子終止。標(biāo)記基因為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptⅡ（圖4）。

2.2轉(zhuǎn)CaM基因棉花的分子鑒定

2.2.1PCR檢測。為獲得能夠正常表達(dá)CaM基因的轉(zhuǎn)基因棉花，對234株T0單株進(jìn)行了鑒定。利用CaM基因特異的上下游引物CAMF/CAMR，對T0代單株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中DNA-PCR檢測篩選得到15株陽性植株，圖5為部分檢測結(jié)果。

2.2.2RT-PCR檢測。提取受體材料和PCR檢測初步挑選出的15株陽性植株的RNA，電泳檢測無小分子彌散，說明RNA提取過程中沒有發(fā)生降解；電泳條帶無拖尾，點樣孔處無亮帶，說明提取的RNA中無蛋白質(zhì)雜質(zhì)：RNA質(zhì)量較好，可以作為下一步PCR擴(kuò)增模板。把上述RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去除假陽性株，篩選得到3株在300bp左右處有條帶（圖6）的陽性植株。可見，該基因在棉花中能夠表達(dá)；但整體轉(zhuǎn)化率還比較低，僅為1.3%。

2.2.33個轉(zhuǎn)CaM基因陽性株后代的PCR檢測和T4代基因回收測序結(jié)果。對3個轉(zhuǎn)CaM基因株系各代自交獲得的T1、T2、T3植株分別進(jìn)行PCR檢測，將檢測到目的基因的植株進(jìn)行自交，并對T4部分植株在四葉期進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CaM基因在本代中均存在（圖7）。用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與改造后的CaM基因序列一致，該序列與石斑魚鈣調(diào)蛋白基因CaM（GenBank：KC540636）比對，結(jié)果為石斑魚鈣調(diào)蛋白基因CaM中的一段序列（圖8）。

2.3低溫（4℃）處理對轉(zhuǎn)基因和受體棉花的生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1植株的耐低溫試驗。在棉花四葉期對受體及陽性植株進(jìn)行耐低溫能力的初步鑒定，經(jīng)過處理后，受體植株葉片逐漸萎蔫，而篩選出的含有CaM基因的植株能夠恢復(fù)正常，表觀結(jié)果差異顯著（圖9）。

2.3.2低溫處理對棉花葉片中的MDA含量的影響。由圖10-A可見：常溫23℃下轉(zhuǎn)基因棉花株系（C1、C2、C3）與對照葉片中MDA含量均在40μmol•g－1左右，無明顯差異。經(jīng)過低溫處理后，轉(zhuǎn)基因棉花各株系葉片中MDA含量比常溫高25%左右，株系間差異不顯著（分別為54.58，52.62，49.59μmol•g－1），而對照棉花葉片中MDA含量顯著上升為77.04μmol•g－1，比常溫下高90%左右，且顯著高于轉(zhuǎn)基因株系。

2.3.3低溫處理對棉花葉片中SOD、POD活力的影響。由圖10-B和圖10-C可見：在室溫下，對照和各株系的SOD、POD活力沒有明顯差異；在低溫處理后，轉(zhuǎn)基因株系葉片SOD、POD的活力顯著高于對照的。

2.3.4低溫處理對棉花葉片中可溶性糖含量的影響。陸地棉的品種抗寒能力與其在低溫鍛煉中可溶性糖的積累有十分密切的關(guān)系：可溶性糖積累可增大細(xì)胞液的濃度，以抵抗低溫對細(xì)胞膜造成的損傷。由圖10-D可見：低溫處理后轉(zhuǎn)基因株系葉片中的可溶性糖的含量明顯高于受體植株；而在室溫下，轉(zhuǎn)基因株系與受體間的差異不顯著。

3討論與結(jié)論

一般認(rèn)為，0℃以上低溫脅迫對冷敏感植物的損傷首先是改變了磷脂雙層膜的膜相，尤其是改變了質(zhì)膜的空間構(gòu)象和物理狀態(tài)。膜相的改變可顯著抑制細(xì)胞膜正常功能的發(fā)揮，而構(gòu)象的改變則強(qiáng)烈影響膜的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)從膜上解離，并發(fā)生膜融合[17]。而Ca2+-CaM信使系統(tǒng)是調(diào)節(jié)植物抗寒性形成的有關(guān)生理生化過程的重要信號系統(tǒng)，Ca2+濃度的變化可以影響磷脂酶D的活力，進(jìn)而進(jìn)行膜脂代謝的調(diào)節(jié)[18]。此外，低溫能夠引起植物代謝過程及大量產(chǎn)物的變化，全面了解調(diào)控這些過程的關(guān)鍵基因，將有助于提高植物抗寒性。代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶的變化能夠反映出植物耐低溫的程度。在低溫脅迫下，MDA會積累造成細(xì)胞膜孔隙變大，細(xì)胞膜透性上升，電導(dǎo)率變大，電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。SOD、POD作為清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基的保護(hù)酶，對于維護(hù)植物尤其是處在低溫脅迫中的植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除的代謝平衡起到極其重要的作用。在水稻幼苗受到低溫脅迫時，過氧化酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在內(nèi)的抗氧化酶活力增強(qiáng)，植株體內(nèi)過氧化氫和丙二醛積累減少[19]。杜萍[20]通過對轉(zhuǎn)BvM14-CaM基因的煙草進(jìn)行低溫、高溫、高滲、高鹽4種逆境脅迫處理，發(fā)現(xiàn)外源基因的插入提高了轉(zhuǎn)化植株對4種逆境的耐受力。這表明，CaM基因的表達(dá)與植物的抗逆性有關(guān)。很多植物在受到逆境脅迫之后，都會產(chǎn)生活性氧從而提高植物體內(nèi)各種抗氧化酶的活力。

本研究中，所檢測棉花植株在受到低溫脅迫后，體內(nèi)產(chǎn)生的SOD、POD等抗氧化酶活力均提高，但轉(zhuǎn)入CaM基因的各株系酶活力上升幅度較大，表明CaM基因可能在一定程度上提高了棉花對低溫逆境的耐受性。逆境脅迫會引起植物體內(nèi)可溶性糖含量的變化。張小蕓等[21]研究轉(zhuǎn)冰草果聚糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Ac1-FFT）的黑麥草時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干旱處理后，轉(zhuǎn)基因黑麥草體內(nèi)的可溶性糖含量明顯高于未轉(zhuǎn)基因的對照植株，這表明可溶性糖含量的提高可能會增強(qiáng)植物的抗逆能力。范月仙等[22]認(rèn)為棉花苗期低溫處理后可溶性糖的提高可以作為抗冷級別的生化指標(biāo)之一。本研究中，對棉花植株進(jìn)行脅迫處理后，轉(zhuǎn)入CaM基因的株系中可溶性糖含量明顯上升，且上升幅度都比對照明顯，表明CaM基因能夠在一定程度上提高棉花的抗低溫能力。目前棉花抗寒性研究手段大多采用人工氣候室模擬低溫條件，雖然可以較好地控制溫度來評價低溫下棉花的表現(xiàn)，但用這種方法來推斷棉花在大田環(huán)境中的抗寒性具有很大的局限性，在以后的研究中應(yīng)更多地結(jié)合野外試驗來綜合評定。此外，轉(zhuǎn)CaM耐低溫基因棉花種質(zhì)尚需深入研究，其生理生化變化及遺傳穩(wěn)定性還需要長期的試驗觀測，并通過完整的轉(zhuǎn)基因安全評價程序，才能在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。與傳統(tǒng)棉花育種方式相比，通過基因工程技術(shù)改善棉花的性狀相對快捷，但對于轉(zhuǎn)基因棉花中，外源基因能否高效穩(wěn)定表達(dá)以及能否在后代中穩(wěn)定遺傳仍然是轉(zhuǎn)基因棉花面臨的難題。外源基因在親代向子代傳遞的過程中，不可避免會產(chǎn)生外源基因片段丟失的現(xiàn)象，這導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花的應(yīng)用受到很大的限制。此外，棉花對逆境脅迫的響應(yīng)是由多種基因協(xié)調(diào)控制的，單一基因的導(dǎo)入的改良效應(yīng)可能較小[23]；因此，應(yīng)通過多個基因聯(lián)合導(dǎo)入來改善棉花的抗逆性。

作者：趙存鵬 郭寶生 王凱輝 劉素恩 王兆曉 劉冬艷 耿軍義 單位：河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室 /國家棉花改良中心河北分中心