根際微生物降解有機氯農藥探析范文

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《福建農業學報》2016年第8期

摘要：

通過盆栽模擬試驗，研究黑麥草Loliummultiforum的根系分泌物對根際微生物降解有機氯農藥的影響效應。結果顯示，在供試OCPs含量（0～343．61mg•kg－1）范圍內，根系分泌物介導下植物－土壤－微生物系統對OCPs污染物的去除具有明顯的促進作用：3個處理中，TR2對OCPs的去除率最高（77．57％），較對照組高出33．49％，較土壤微生物活性被抑制的植物－土壤系統高出58．16％。借助細菌計數法對根際微生物數量的檢測結果則顯示，相同污染水平下，TR2系統里微生物數量最多，CK次之，TR1最少。說明黑麥草的根系分泌物對OCPs去除效果的促進作用可能與根際微生物種群數量的變化有關：根系分泌物的存在提高了根際微生物的種群數量，其降解效能隨之提高。

關鍵詞：

有機氯農藥；黑麥草；根系分泌物；根際微生物

有機氯農藥是一類高殘留、生物富集性強的農藥，性質穩定、水溶性差，極易吸附在土壤中，并通過食物鏈對生態環境和人體健康產生危害［1－3］。我國雖從1983年開始禁止使用OCPs，但目前仍可在多數土壤中檢出［4－6］。隨著全球范圍內對環境保護和食品安全的日益重視，如何去除環境中OCPs殘留已成為環境科學的研究熱點。降解有機氯的方法有很多種，如化學法、物理法和植物修復。其中，植物修復技術因操作簡便、環境友好、修復效果明顯［7］，已成為治理殘留農藥的重要途徑。本研究擬以成都平原主要蔬菜地土壤中OCPs的污染狀況［7］為參照，以研究較多的黑麥草Loliummultiforum為試驗材料，系統研究OCPs復合污染狀態［8］下黑麥草的根系分泌物對根際微生物降解的影響效應、探討其影響機制，為植物修復OCPs技術提供理論與實踐依據。

1材料與方法

1．1試驗材料

土壤：供試土壤為中性紫色土，采自成都大學十陵校區旱地表層，取樣深度為5～15cm。新鮮土樣去除石子和植物殘體，分為兩部分，部分直接過9mm篩后混合均勻，供盆栽培養植物用；部分風干后研磨過2．5mm篩，用于土壤基本性質測定。經檢測，理化性質如下：pH7．19，有機質含量2．14×104mg•kg－1，陽離子交換量20．43cmol•kg－1，速效N、P、K分別為31．62、24．74、94．81mg•kg－1；砂粒、粉粒和黏粒的比例分別為71．27％、9．59％和19．14％。土壤風干后過2mm篩，備用。植物：選取修復效果較好的黑麥草為供試草坪其周邊地區，選擇大小相當植株，用3％H2O2消毒、蒸餾水清洗其根部后作移栽使用。主要儀器：氣相色譜儀－Ni63，電子捕獲檢測器，Agilent7683系列自動進樣器；數控超聲波清洗器、電熱恒溫培養箱、低速離心機、電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、針筒式過濾器、萬用電爐、酸度計、層析柱、分析用研磨機、高壓蒸氣滅菌鍋等。試劑：OCPs混標：HCHs（α－HCH、β－HCH、γ－HCH、δ－HCH）、DDTs（p，p′－DDT、o，p′－DDT、p，p′－DDE、o，p′－DDE、p，p′－DDD）、六氯苯、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、α－氯丹、γ－氯丹、硫丹I、硫丹II、硫丹硫酸鹽、異狄氏劑醛、異狄氏劑酮、七氯、環氧七氯、甲氧滴滴滴，購自Supelco公司；無水硫酸鈉、丙酮、正己烷等為分析純，購自成都市科農化工試劑廠。

1．2OCPs檢測方法

土樣前處理參照GB／T14550－1993的方法。GC－ECD分析［9］：DM－5層析柱（30m×0．32mm×0．25μm），程序升溫：初溫90℃（1min）；40℃•min－1升至170℃，23℃•min－1升至230℃保持17min；40℃•min－1升至280℃保留5min。進樣溫度260℃，檢測溫度300℃；氮氣流速：1mL•min－1；尾吹：60mL•min－1；不分流進樣，進樣量1μL。GC／MS－MS分析：島津氣相色譜，離子阱質譜，色譜－質譜接口溫度250℃，離子源溫度230℃；離子化方式：EI；電子能量：70eV；溶劑延遲：6min；全掃描范圍：40～500AMU。按照此方法，OCPs回收率為90％～120％，檢出限為0．07～0．15μg•kg－1。

1．3試驗設計

1．3．1收集根系分泌物

采用土培法進行黑麥草根系培養，待培養30d后，選擇長勢一致的植株轉入燒杯中培養。移苗后的植株先用蒸餾水緩苗2d，然后更換為Hogland營養液，培養3d，期間每天補充營養液維持液面高度。之后將營養液更換為含定量OCPs（66．67mg•L－1）的半量Hogland營養液，進行OCPs脅迫處理，5d后，黑麥草由脅迫液中移出，洗凈根表面，再順次用0．2mmol•L－1CaSO4和30mg•L－1氯霉素溶液浸泡2h和30min，蒸餾水洗凈3遍后，浸于盛有適量Milli－Q超純水的燒杯中（錫紙包裹杯壁，確保根部避光；液面高度以漫過根部為宜）中收集根系分泌物，每2h更換1次收集液，連續收集4次。合并收集液，過0．45μm的濾膜，對收集液進行真空旋轉蒸發濃縮（40℃），濃縮約4倍后，獲得總有機碳TOC為246mg•L－1的根系分泌物濃縮液，于－20℃保存［10－11］。

1．3．2配置OCPs污染土樣

以成都市區蔬菜地土壤中實際OCPs復合污染狀態［8］為參照，依照一定濃度比例，分別稱取一定量的∑DDT、∑HCH、HCB、艾氏劑、狄氏劑、毒殺芬、滅蟻靈、硫丹Ⅰ、環氧七氯、γ－氯丹等）溶于丙酮溶液中，均勻灑在土壤表層，待丙酮揮發后，多次攪拌，混勻，遮光封口、加蓋，室溫下平衡7d。GC／MS－MS法測定土壤中OCPs初始濃度為343．61mg•kg－1，其中，∑DDT、∑HCH、HCB、艾氏劑、狄氏劑、狄氏劑、毒殺芬、滅蟻靈、硫丹Ⅰ、環氧七氯、γ－氯丹的含量分別為299．52、14．49、8．13、1．05、1．89、3．21、1．98、1．65、3．42和8．27mg•kg－1。以此為基礎，分別用一定量未污染土對C5土樣進行稀釋，攪拌混勻，遮光條件下室溫內下平衡7d后，測得其含量分別為：66．67mg•kg－1、138．47mg•kg－1、205．14mg•kg－1、282．07mg•kg－1。

1．3．3模擬修復試驗

3個處理、5個重復，①處理1（對照，CK）：OCPs污染土樣；②處理2（TR1）：加入0．05％NaN3（抑制微生物活性）的OCPs污染土樣；③處理3：加入黑麥草根系分泌物的OCPs污染土樣。溫室平衡7d后，檢測各處理中OCPs殘留量。

1．3．4細菌培養與計數

精確稱量牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂20g配制溶液，用10mol•L－1NaOH將pH調至7左右。熱溶后，將培養基分裝于5個三角錐形瓶中、加塞，0．103MPa、120℃條件下高壓蒸汽滅20Min菌［12］。將滅菌后的培養基在沒有凝固之前倒入同樣滅菌的平板（共288套）中；混菌法［13］分別對不同處理各個污染水平的根際土壤懸液接種，共15組，另設無OCPs污染土樣做對照，并按照一定濃度梯度（取0、10、20、30、40、50mL根系分泌物濃縮液定容至50mL）分別向TR2處理的16組平板中加入2mL根系分泌物濃縮液，各設置3個重復。20℃、無菌條件下恒溫培養7d后，計算各自菌落數。

1．4數據處理

采用Excel2007軟件進行數據處理、SPSS13．0軟件LSD法分析不同處理間差異顯著性。其中，OCPs降解率（R）計算式為：R＝［（C0－Ct）／C0］×100％；C0代表土壤中OCPs初始濃度，Ct表示各處理下土壤中的殘留濃度。

2結果與分析

2．1不同處理土壤中OCPs的降解差異

模擬修復試驗于溫室平衡7d后，CK、TR1、TR2處理所在土壤中OCPs的降解率與初始濃度關系如圖1所示。可以看出，隨著OCPs的污染水平的增加，OCPs的殘留量越高；相同污染水平下，土壤中OCPs的降解率表現為TR2＞CK＞TR1，差異顯著（P＜0．05）。在去除效果上，土壤－根系分泌物系統所在土壤中OCPs降解率平均為77．57％；微生物活性被抑制的土壤中所在土壤中OCPs降解率平均為19．41％；土壤系統所在土壤OCPs降解率為44．08％，不同處理間差異顯著（P＜0．05）。因自然光解、揮發、吸附等因素對植物修復的貢獻相對較小［14］，TR2處理中OCPs的高降解率可能與所添加的根系分泌物有關。

2．2根系分泌物添加量對OCPs降解率的差異

圖2為根系分泌物添加量對同一污染水平土壤中OCPS修復效果的影響。可以看出，根系分泌物的添加量不同，土壤系統降解率也不一樣，總體上OCPs修復效果隨根系分泌物添加量的增加而增強，添加量為30mL（約合7．38mgTOC）時增幅最大。

2．3不同處理土壤中細菌數差異

圖3為不同污染水平下不同處理中細菌總數差異。同一個污染水平下（圖3－A），TR2的細菌數最多，CK次之、TR1最少，三者差異顯著（P＜0．05）。說明根系分泌物的存在使得土壤修復系統中細菌總數增加。相同處理條件下（圖3－B），除添加0．05％的NaN3（抑制微生物活性）的TR1處理外，土壤中細菌總數均隨著OCPs污染水平的升高而增多，在C5水平時均明顯高于無污染對照土壤，其原因可能與高濃度的污染物存在能夠為細菌生長提供更多的可利用碳源有關。

2．4不同根系分泌物添加量土壤中細菌數差異

圖4為相同污染水平（C3）下TR2處理中不同根系分泌物添加量對細菌總數的影響。可以看出，根系分泌物添加量越多，根際土壤中細菌總數越多，說明根系分泌物的存在加快了細菌的生長代謝，使得細菌的種群數量增加。試驗含量范圍內，其他污染水平條件下，根系分泌物添加量對細菌總數的影響趨勢與C3污染水平下相同。

3討論與結論

植物的存在能加快土壤中有機污染物的去除，根系分泌物營造的根際環境則是污染物快速消解的重要原因［15］。植物修復過程中，根系分泌物在改善土壤屬性、提高污染物生物可利用性、緩解環境脅迫等方面具有重要作用。一方面，根系分泌的某些胞外酶能夠直接參與污染物的降解過程；另一方面，分泌物中的可溶性糖、低分子量有機酸、氨基酸等物質，為根際微生物提供充足的營養，增加根際微生物的數量、提高微生物活性，進而加速污染物降解。同時，根系分泌物還會直接影響污染物的固定和活化，進而影響污染物在土壤－植物系統中的遷移轉化行為、促進OCPs的去除［16］。本研究表明，黑麥草根系分泌物對OCPs降解有促進作用。降解平衡7d后，根系分泌物介導下植物－土壤－微生物系統中OCPs降解率為77．57％，去除效果明顯大于CK、TR1。相同污染水平下，TR2中細菌總數明顯大于CK，說明根系分泌物對細菌的生長代謝有促進作用；相同污染水平下，土壤中細菌總數隨根系分泌物添加量的增加而增加，說明根系分泌物為細菌的生長代謝提供了營養條件，到達一定限值后，根系分泌物濃度對細菌總數的影響逐漸減小，這是因為土壤微生物對其自身的營養達到飽和。研究顯示，根系分泌物促進了土壤中微生物的生長發育，進而使得土壤中OCPs降解率的增大。盡管土壤吸附、揮發、光解等過程也是土壤中OCPs的減少原因之一，但根系分泌物－微生物間的交互作用是修復土壤OCPs污染的主要途徑。本研究中，TR1中OCPs濃度的降低，主要是非生物（揮發、光解、土壤吸附等）作用的結果，但非生物因素的去除不是主要的原因，僅占19．41％。而CK中OCPs濃度的降低主要有兩方面原因：第一，土壤中固有微生物分解即土壤微生物的降解作用，這部分作用貢獻率可用TR1的平均去除率減去CK的平均去除率得到，土壤微生物降解作用為24．67％，可見，土壤微生物的去除也不是OCPs去除的主要原因；第二，非生物作用（揮發、光解、土壤吸附）的結果，這部分作用與TR1的去除率相同，為19．41％。對比分析CK與TR1可知，微生物作用為24．67％，非生物因素作用為19．41％，污染土壤中微生物降解OCPs效果高于非生物因素，CK處理土壤比TR1處理土壤多降解的OCPs為微生物作用的結果。TR2中OCPs去除，是土壤微生物分解、非生物作用（揮發、光解、土壤吸附等）、根系分泌物對根際微生物降解效能促進作用等因素共同作用的結果。其中，根系分泌物與微生物共同作用為77．57％，根系分泌物促進微生物降解為33．49％。對比分析不同處理中OCPs殘留量可知，黑麥草根系分泌物的存在對土壤中OCPs降解具有促進作用。相同污染水平下，土壤中細菌總數隨根系分泌物添加量的增加而增加，到一定限值后增加趨勢減小，其主要原因是根系分泌物的存在為微生物的生長提供了能量，加快了微生物生長代謝的速度，土壤中微生物數量迅速增加，其降解率也就相應增加。可見，在整個過程中，根系分泌物起到了增加微生物的數量和提高微生物降解效能的作用，同時土壤中的根系分泌物含量到達一定值后，即超過了微生物所需的能量，則根系分泌物對微生物的影響也減小。也就是說，根系分泌物到達一定的范圍后，微生物生長代謝所需營養達到飽和，所以根系分泌物添加量對細菌數目的影響減小。植物修復過程中，根系分泌物對根際微生物的降解效能具有促進作用。在7d的修復平衡試驗中，約有77．57％的OCPs被降解，但非生物因子作用僅占土壤中OCPs總量的19．41％，微生物作用占44．08％，根系分泌物－微生物協同作用比微生物單獨作用OCPs的殘留量低33．49％。根系分泌物的存在為微生物生長代謝提供營養和能量物質、代謝活性加快，微生物種群數量增多，進而強化了根際微生物的降解效能、提高了土壤中OCPs降解率。

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作者:潘聲旺 劉燦 黃方玉 單位:成都大學城鄉建設學院