煙蚜繭蜂多分DNA病毒的形態特征范文

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《東北農業科學雜志》2016年第一期

摘要：

多分DNA病毒（polydnavirus,PDV）是一類共生于膜翅目姬蜂科、繭蜂科和蚜繭蜂科寄生蜂體內的昆蟲病毒。在寄生過程中，伴隨著蜂卵的產出，寄生蜂將PDV注入寄主體內，通過病毒基因的表達，破壞寄主的免疫，以保障后代的存活。本文首次在煙蚜繭蜂和蚜蟲模式體系內發現多分dna病毒，初步明確其形態特征和生理效應。

關鍵詞：

煙蚜繭蜂；多分DNA病毒；形態特征；生理效應

PDV被寄生蜂注射入寄主昆蟲體內，能調節寄主的生理功能，保證寄生蜂在寄主體內的成功發育[1]。研究表明，在寄生蜂寄生寄主昆蟲過程中，多種調控因子參與以保證寄生蜂成功寄生[2-4]。其中,多分DNA病毒直接侵染或間接作用于寄主漿細胞和顆粒細胞，改變寄主血細胞行為，抑制寄主的細胞免疫反應，使蜂卵免遭包囊[5-6]。PDV的這種免疫抑制作用方式在不同的系統是不同的。要進一步研究PDV對于調節寄主免疫及其他生理功能的機理，對其在寄主組織中的侵染及表達情況進行檢測是必不可少的[7]。筆者實驗室建立煙蚜繭蜂和煙蚜系統，發現在煙蚜繭蜂雌蜂卵巢內亦含有PDV，在寄主體內不能復制但可以進行表達，以原病毒的形式整合在寄生蜂基因組中，并垂直傳播給下一代，雄蜂也能夠通過交配將其所含的病毒基因組傳遞給下一代雌蜂。本文就在煙蚜繭蜂體內首次發現并對PDV進行分離提純并進行鑒定以及明確其生物學功能，以期將來進行更有效的研究，并揭示其作用機制。

1試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蟲源采用大小為（2×2×4）m3的雙層繁蜂室（實驗室自行設計）放置50盆（Φ=6～7cm）栽蘿卜，當蘿卜長成高于5cm時接入經鑒定的蚜蟲，經蚜蟲擴繁后，接入煙蚜繭蜂使其擴繁；栽植的蘿卜視其生長情況進行更換，更換時將帶蚜葉片取下粘附在新生長的葉片上，當蚜量增多時也可自然轉移。每天收集僵蚜1次，置于大型指形管（Φ=2.5cm,h=10cm）中，放于0℃冰箱中備用。

1.1.2煙蚜繭蜂卵巢的獲得待煙蚜繭蜂羽化出蜂后，取200頭雌蜂放于-20℃冰箱中5min使其麻醉，置于滴有1滴無菌生理鹽水的載玻片上，用尖嘴鑷子將腹部取下，解剖腹部末端，得到雌蜂生殖系統，將卵巢及輸卵管取下，用無菌生理鹽水清洗后放入冰浴的Ringer's溶液中。將解剖得到的卵巢放于玻璃勻漿器中勻漿，連同生理鹽水吸入離心管中。

1.1.3紫外光輻射處理雌蜂用30W紫外燈光照射交配過的200頭雌蜂3h，分別寄生100頭3～4齡若蚜。隨后按上述方法讓其寄生2齡末、3齡、4齡初若蚜，每日解剖20頭被寄生各齡期寄主，觀察各處理寄生蜂卵孵化情況。以未經照射處理的正常雌蜂寄生的同齡若蚜做比較，觀察假寄生對寄主若蚜發育的影響，同時以未寄生的同齡若蚜作對照[8]。

1.1.4被寄生蚜蟲的解剖將上述3～4齡若蚜200頭分別放到100個指形管（Φ=1.0cm，h=5.0cm）中，再分別引入100頭雌蜂，使每個指形管中有2頭蚜蟲和1頭雌蜂，持續產卵1h后，取出被寄生的煙蚜，放在75%的酒精中消毒，再用無菌生理鹽水清洗除去雜質及酒精，然后將煙蚜放在滴有4℃冰冷的無菌生理鹽水的載玻片上，用解剖針剔除蟲體的前胸和翅，以一針按住腹部前端的腹面，用另一針自腹部前端背面起，輕輕拉開蚜蟲體壁，再用自制的毛細吸管將血淋巴吸入到冰冷的離心管中備用。

1.2試驗方法

1.2.1PDV的分離純化PDV的分離純化參照Krell和Beckage等的方法[9-10]。用TL-18M型臺式高速冷凍離心機在8000r/min離心3min，以去掉組織碎片，沉淀用Ringer's溶液洗1次后再離心1次，合并上清液，作為提純PDV的樣品。將樣品鋪在25%～65%（W/V）的蔗糖連續梯度上，用Hitachi,P50離心機在48000r/min（HITA⁃CHISCR20BC冷凍高速離心機HirachikokiCo.LTd.,TokyoJapan日立RP30A轉頭）4℃下離心6h。用毛細管收集沉降帶后，再用Ringer's溶液洗1遍，在48000r/min4℃下再離心30min，將沉淀溶于適量的Ringer's溶液中，于-70℃冰箱保存。

1.2.2鏡檢

1.2.2.1取材取上述所得的上清液，倒少量置于蠟板上的雙蒸水中，靜置15min，使其自行擴散成懸浮液。

1.2.2.2制樣將敷有福爾莫瓦膜的載網漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干余液，使樣品在載網上僅有一薄層液膜；同時，用2%磷鎢酸（pH6.8）染色1～2min,用濾紙吸干多余的染液。

1.2.2.3微形態觀察在透射電子顯微鏡下進行微形態觀察。

2結果與討論

2.1形態學特性用蔗糖密度梯度離心法提純的病毒，可在第3條沉降帶（蔗糖40%濃度）出現。經電鏡觀察，收集的沉降帶及煙蚜繭蜂卵巢萼液中的病毒粒子如圖1、圖2所示。該病毒粒子呈多面體狀，數量較少，無包涵體。可初步證明在煙蚜繭蜂卵巢萼液中有毒粒子存在。被寄生的桃蚜體內毒粒子呈多面體，形狀與煙蚜繭蜂卵巢萼液中毒粒子相似，可認為該病毒粒子是煙蚜繭蜂產卵時攜帶進來的。蚜繭蜂卵巢萼液和被寄生的蚜蟲體液經過離心處理，經負染色，在透射電子顯微鏡下可觀察到病毒粒子，經確認是多分DNA病毒（圖3）。本研究取材僅有100對煙蚜繭蜂的卵巢，經梯度離心提純后，病毒粒子的濃度較小，因此在用電鏡觀察到的病毒粒子較少，應取材更多。

2.2生理效應經紫外光處理后的雌蜂都能正常產卵寄生，對被寄生寄主的發育歷期進行連續解剖發現，96.4%±2.8%不能孵化，個別發育不完善，并且絕大多數的蜂卵未能被寄主的免疫系統所識別而進行血細胞包囊。假寄生的2齡末、3齡和4齡初寄主若蟲期延長，對一次假寄生的寄主而言，若蟲期延長8～12d，而多次假寄生的寄主，當發育到第11d后，轉化成僵蚜，說明PDV與復合因子劑量增加對寄生生長和發育有明顯抑制作用[11]。4齡末蚜蟲若蟲被假寄生后，即使被過寄生6次，依然能正常發育，但隨后轉化成僵蚜（圖4）。

3結論與討論

本文證實煙蚜繭蜂體內存在多分DNA病毒，其功能是直接侵染或間接作用于寄主漿細胞和顆粒細胞，改變寄主血細胞行為，抑制寄主細胞免疫反應，破壞寄主免疫，使蜂卵免遭包囊以確保子代存活，對寄主生長和發育有明顯抑制作用。在病毒與寄主昆蟲長期進化過程中，PDV可通過調節寄主的內分泌來加快或減慢寄主的發育等途徑來調節寄主幼蟲生長期的長短，如可通過降低保幼激素酯酶的活性[12]。但對于煙蚜繭蜂和蚜蟲模式體系內PDV是如何作用于寄主，是否整合于寄生蜂的染色體上，進入寄主體內是以何種方式進行轉染及表達[13-14]，以上所有情況尚需作進一步的研究。未來在完全明確多分DNA病毒基因的功能和表達調控機理的基礎上，可選用合適的昆蟲轉座子，以顯微注射等方法將多分DNA病毒基因整合到害蟲基因組中，培育出免疫力和繁殖力下降，發育紊亂的害蟲品系，通過在田間散發這種轉基因害蟲，以達到控制種群的目的[15-16]。多分DNA的應用前景比較廣闊，對它做進一步研究很有價值和意義[17]。

作者：李艷紅 劉金文 顏秀娟 單位：吉林農業工程職業技術學院 吉林省農業科學院