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成蝦流行疾病的病因探析范文

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成蝦流行疾病的病因探析

作者:徐洋沈錦玉姚嘉赟潘曉藝郝貴杰尹文林楊國梁王軍毅單位:浙江省淡水水產(chǎn)研究所浙江湖州

人工感染試驗

將供試菌株接種于TSB培養(yǎng)液,28℃恒溫培養(yǎng)24h后,用生理鹽水將菌液分別稀釋至108、107、106、105CFU/mL,每個稀釋度注射3個試驗組,每個試驗組選取30尾體長為10cm的健康羅氏沼蝦成蝦,在靠近尾扇第3腹節(jié)處注射菌液,對照組注射生理鹽水,注射量為0.15mL/尾。養(yǎng)殖用水為健康蝦塘水,水溫(26±2)℃,記錄每天成蝦的死亡情況。

主要致病菌的鑒定

1形態(tài)觀察

觀察致病菌的菌落形態(tài),亞甲藍染色觀察細菌的形態(tài),革蘭氏染色進行鑒別試驗。

2生理生化特性測定

根據(jù)革蘭氏染色的結(jié)果選取相應的細菌生化鑒定管進行生理生化試驗,參照細菌生化鑒定編碼冊判定結(jié)果。

3PCR鑒定

參照文獻的方法,設計針對細菌16SrRNA基因的特異性引物進行PCR擴增。引物由上海英駿生物技術有限公司合成,序列為P15''''-AGGTTGATGCCTAATACGTA-3''''和P25''''-CGTGCTG-GCAACAAAGGACAG-3''''。用試劑盒提取細菌的DNA作為模板,PCR反應體積為50μL,包括:Buffer(含MgCl2)5μL;DNTP(10mmol/L)4μL;ddH2O38μL;引物(10μmol/L)各1μL;Taq酶0.5μL;細菌模板0.5μL。反應條件:95℃預變性3min,94℃變性40s,51℃退火40s,72℃延伸90s,共進行35個循環(huán),最后在72℃繼續(xù)延伸8min,將產(chǎn)物送至上海英駿生物技術有限公司進行測序。1.7藥物敏感性試驗取適量的細菌培養(yǎng)液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上,貼上藥敏試紙,恒溫28℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑,并根據(jù)抑菌圈直徑和各種抗菌藥物的具體標準判定其是否敏感。

結(jié)果

1流行病學調(diào)查結(jié)果

初步統(tǒng)計2009—2010年長三角地區(qū)羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病:具體癥狀為體色發(fā)白,特別是尾扇部有白色斑點(以上海崇明和浙江嘉興病樣為主);藍體病:具體癥狀為食欲減退,行動遲緩,全身均為深藍色,肌肉也呈淡藍色(以江蘇高郵病樣為主);紅體病:具體癥狀為軀體與附肢變紅,腮部變黃且出現(xiàn)大水泡,眼睛凹陷或脫落(以浙江湖州病樣為主)。

2電鏡觀察

病樣電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒樣顆粒。

3病樣與病原菌的分類

用細菌學方法從病樣的血液和肝胰腺中分離到優(yōu)勢菌11株,并對11株優(yōu)勢菌進行命名,結(jié)合2.1中三類不同的患病癥狀,將所得優(yōu)勢菌進行分類,結(jié)果見表1。

4主要致病菌的篩選

根據(jù)11株優(yōu)勢菌人工感染試驗結(jié)果(表2),結(jié)合三類不同的患病癥狀,篩選出死亡率最高的3株細菌,分別為SHB1、GYB8、HZL2。這3株細菌人工感染的病蝦癥狀與其分離的病癥相似,且將人工感染的病蝦進行細菌分離能復制出原始的菌落形態(tài)與細菌形態(tài),因此判斷SHB1、GYB8、HZL2為主要致病菌。

5主要致病菌的鑒定

菌落形態(tài)觀察

SHB1在TSA培養(yǎng)基上為灰白色圓形菌落,邊緣光滑、中央凸起,細菌形態(tài)為短桿狀(圖1),革蘭氏染色呈紅色,初步判斷為革蘭氏陰性菌;GYB8在TSA培養(yǎng)基上為半透明的突起圓形小菌落,細菌形態(tài)為直桿狀(圖2),革蘭氏染色為紅色,初步判斷為腸桿菌科;HZL2在TSA培養(yǎng)基上為白色大菌落,不規(guī)則形態(tài)呈片狀生長,有遷徙生長的特性,細菌形態(tài)為兩端鈍圓的小桿菌(圖3),且革蘭氏染色為紅色,初步判斷為變形桿菌屬。

生理生化特性測定

根據(jù)形態(tài)染色的結(jié)果,參照相應細菌生化鑒定編碼冊進行生理生化試驗,具體結(jié)果見表3。結(jié)果表明:SHB1、GYB8和HZL2依次為氣單胞菌屬(Aeromonas)、費氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreun-dii)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)。

PCR鑒定

PCR擴增得到與預期大小相符的DN段(圖4),其中SHB1的PCR產(chǎn)物共測出1066bp的序列,與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)N2株同源性最高,為100%,因此可確定該細菌為嗜水氣單胞菌;GYB8的PCR產(chǎn)物共測出1457bp的序列,與費氏檸檬酸桿菌HPG143株同源性最高,為100%,因此可確定該細菌為費氏檸檬酸桿菌;HZL2的PCR產(chǎn)物共測出1175bp的序列,與普通變形桿菌SBP10株同源性最高,為95%,因此可確定該細菌為普通變形桿菌。3株主要致病菌的序列結(jié)果見圖5-7。

6藥物敏感性試驗

對SHB1、GYB8和HZL2進行常用抗生素的藥物敏感試驗,結(jié)果見表4。結(jié)果表明3株主要致病菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感。

討論

本研究初步統(tǒng)計2009—2010年長三角地區(qū)羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病、藍體病和紅體病,且三類疾病有明顯的地域性。目前國內(nèi)梁森漢等對病蝦進行了病原分離和回歸感染等試驗,認為細菌是羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原;姜蘭等從患白濁病的羅氏沼蝦蝦苗病灶分離到多株菌株,其中一株經(jīng)人工感染證實為病原菌,經(jīng)自動細菌鑒定儀測試為木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus);筆者通過病原鑒定發(fā)現(xiàn)本次采集到的肌肉白濁病病樣的主要致病菌是嗜水氣單胞菌,由嗜水氣單胞菌引發(fā)的水生動物暴發(fā)性疾病屢屢發(fā)生,但目前甚少見到嗜水氣單胞菌引起羅氏沼蝦成蝦死亡。藍體病目前在國內(nèi)外極少見相關報道,該病癥在江蘇高郵地區(qū)極為普遍,其主要致病菌是費氏檸檬酸桿菌,該病癥表現(xiàn)為肌肉呈淡藍色,由于蝦的血液為藍色,考慮費氏檸檬酸桿菌是否存在使血液凝集的致病因子。費氏檸檬酸桿菌導致水產(chǎn)動物患病死亡的病例較少,李華等首次報道費氏檸檬酸桿菌是河蟹(Eriocheirsinensis)的致病菌,沈錦玉等研究認為,費氏檸檬酸桿菌是紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的致病菌。紅體病通常都爆發(fā)于仔蝦中,有學者認為是一種由副溶血弧菌感染引起的細菌病,本研究發(fā)現(xiàn)其主要致病菌為普通變形桿菌,許兵等曾在對蝦上分離到該病原菌,普通變形桿菌易引發(fā)的人類疾病,是人畜共患致病菌之一,因此需加強對該類疫病的檢測,以防危害人類健康。

分離菌株的藥物敏感性試驗表明,3種主要致病菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感,在生產(chǎn)上使用這兩種藥物也有一定的效果,但由于甲殼類動物構(gòu)造及食性方面的特性[19],一定程度上阻礙了藥物的吸收,且普通變形桿菌等宿主范圍較廣,在許多生物中均可以感染,屬于人畜共患致病菌之一,因此養(yǎng)殖場不能盲目用藥,以免給整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成更大的經(jīng)濟損失。因而,切斷疾病的傳染源、保持養(yǎng)殖環(huán)境的穩(wěn)定性、提高蝦的抗病力,才有利于防治蝦病發(fā)生。

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