成蝦流行疾病的病因探析范文
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作者：徐洋沈錦玉姚嘉赟潘曉藝郝貴杰尹文林楊國梁王軍毅單位：浙江省淡水水產研究所浙江湖州
人工感染試驗
將供試菌株接種于TSB培養液，28℃恒溫培養24h后，用生理鹽水將菌液分別稀釋至108、107、106、105CFU/mL，每個稀釋度注射3個試驗組，每個試驗組選取30尾體長為10cm的健康羅氏沼蝦成蝦，在靠近尾扇第3腹節處注射菌液，對照組注射生理鹽水，注射量為0.15mL/尾。養殖用水為健康蝦塘水，水溫(26±2)℃，記錄每天成蝦的死亡情況。
主要致病菌的鑒定
1形態觀察
觀察致病菌的菌落形態，亞甲藍染色觀察細菌的形態，革蘭氏染色進行鑒別試驗。
2生理生化特性測定
根據革蘭氏染色的結果選取相應的細菌生化鑒定管進行生理生化試驗，參照細菌生化鑒定編碼冊判定結果。
3PCR鑒定
參照文獻的方法，設計針對細菌16SrRNA基因的特異性引物進行PCR擴增。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，序列為P15''''-AGGTTGATGCCTAATACGTA-3''''和P25''''-CGTGCTG-GCAACAAAGGACAG-3''''。用試劑盒提取細菌的DNA作為模板，PCR反應體積為50μL，包括:Buffer(含MgCl2)5μL;DNTP(10mmol/L)4μL;ddH2O38μL;引物(10μmol/L)各1μL;Taq酶0.5μL;細菌模板0.5μL。反應條件:95℃預變性3min，94℃變性40s，51℃退火40s，72℃延伸90s，共進行35個循環，最后在72℃繼續延伸8min，將產物送至上海英駿生物技術有限公司進行測序。1.7藥物敏感性試驗取適量的細菌培養液均勻涂布于TSA培養基上，貼上藥敏試紙，恒溫28℃培養24h后測量抑菌圈直徑，并根據抑菌圈直徑和各種抗菌藥物的具體標準判定其是否敏感。
結果
1流行病學調查結果
初步統計2009—2010年長三角地區羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病:具體癥狀為體色發白，特別是尾扇部有白色斑點(以上海崇明和浙江嘉興病樣為主);藍體病:具體癥狀為食欲減退，行動遲緩，全身均為深藍色，肌肉也呈淡藍色(以江蘇高郵病樣為主);紅體病:具體癥狀為軀體與附肢變紅，腮部變黃且出現大水泡，眼睛凹陷或脫落(以浙江湖州病樣為主)。
2電鏡觀察
病樣電鏡觀察未發現明顯的病毒樣顆粒。
3病樣與病原菌的分類
用細菌學方法從病樣的血液和肝胰腺中分離到優勢菌11株，并對11株優勢菌進行命名，結合2.1中三類不同的患病癥狀，將所得優勢菌進行分類，結果見表1。
4主要致病菌的篩選
根據11株優勢菌人工感染試驗結果(表2)，結合三類不同的患病癥狀，篩選出死亡率最高的3株細菌，分別為SHB1、GYB8、HZL2。這3株細菌人工感染的病蝦癥狀與其分離的病癥相似，且將人工感染的病蝦進行細菌分離能復制出原始的菌落形態與細菌形態，因此判斷SHB1、GYB8、HZL2為主要致病菌。
5主要致病菌的鑒定
菌落形態觀察
SHB1在TSA培養基上為灰白色圓形菌落，邊緣光滑、中央凸起，細菌形態為短桿狀(圖1)，革蘭氏染色呈紅色，初步判斷為革蘭氏陰性菌;GYB8在TSA培養基上為半透明的突起圓形小菌落，細菌形態為直桿狀(圖2)，革蘭氏染色為紅色，初步判斷為腸桿菌科;HZL2在TSA培養基上為白色大菌落，不規則形態呈片狀生長，有遷徙生長的特性，細菌形態為兩端鈍圓的小桿菌(圖3)，且革蘭氏染色為紅色，初步判斷為變形桿菌屬。
生理生化特性測定
根據形態染色的結果，參照相應細菌生化鑒定編碼冊進行生理生化試驗，具體結果見表3。結果表明:SHB1、GYB8和HZL2依次為氣單胞菌屬(Aeromonas)、費氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreun-dii)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)。
PCR鑒定
PCR擴增得到與預期大小相符的DN段(圖4)，其中SHB1的PCR產物共測出1066bp的序列，與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)N2株同源性最高，為100%，因此可確定該細菌為嗜水氣單胞菌;GYB8的PCR產物共測出1457bp的序列，與費氏檸檬酸桿菌HPG143株同源性最高，為100%，因此可確定該細菌為費氏檸檬酸桿菌;HZL2的PCR產物共測出1175bp的序列，與普通變形桿菌SBP10株同源性最高，為95%，因此可確定該細菌為普通變形桿菌。3株主要致病菌的序列結果見圖5－7。
6藥物敏感性試驗
對SHB1、GYB8和HZL2進行常用抗生素的藥物敏感試驗，結果見表4。結果表明3株主要致病菌對環丙沙星和恩諾沙星高度敏感。
討論
本研究初步統計2009—2010年長三角地區羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病、藍體病和紅體病，且三類疾病有明顯的地域性。目前國內梁森漢等對病蝦進行了病原分離和回歸感染等試驗，認為細菌是羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原;姜蘭等從患白濁病的羅氏沼蝦蝦苗病灶分離到多株菌株，其中一株經人工感染證實為病原菌，經自動細菌鑒定儀測試為木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus);筆者通過病原鑒定發現本次采集到的肌肉白濁病病樣的主要致病菌是嗜水氣單胞菌，由嗜水氣單胞菌引發的水生動物暴發性疾病屢屢發生，但目前甚少見到嗜水氣單胞菌引起羅氏沼蝦成蝦死亡。藍體病目前在國內外極少見相關報道，該病癥在江蘇高郵地區極為普遍，其主要致病菌是費氏檸檬酸桿菌，該病癥表現為肌肉呈淡藍色，由于蝦的血液為藍色，考慮費氏檸檬酸桿菌是否存在使血液凝集的致病因子。費氏檸檬酸桿菌導致水產動物患病死亡的病例較少，李華等首次報道費氏檸檬酸桿菌是河蟹(Eriocheirsinensis)的致病菌，沈錦玉等研究認為，費氏檸檬酸桿菌是紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的致病菌。紅體病通常都爆發于仔蝦中，有學者認為是一種由副溶血弧菌感染引起的細菌病，本研究發現其主要致病菌為普通變形桿菌，許兵等曾在對蝦上分離到該病原菌，普通變形桿菌易引發的人類疾病，是人畜共患致病菌之一，因此需加強對該類疫病的檢測，以防危害人類健康。
分離菌株的藥物敏感性試驗表明，3種主要致病菌對環丙沙星和恩諾沙星高度敏感，在生產上使用這兩種藥物也有一定的效果，但由于甲殼類動物構造及食性方面的特性［19］，一定程度上阻礙了藥物的吸收，且普通變形桿菌等宿主范圍較廣，在許多生物中均可以感染，屬于人畜共患致病菌之一，因此養殖場不能盲目用藥，以免給整個水產養殖業造成更大的經濟損失。因而，切斷疾病的傳染源、保持養殖環境的穩定性、提高蝦的抗病力，才有利于防治蝦病發生。
