IBV核蛋白的表達(dá)純化范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了IBV核蛋白的表達(dá)純化參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《中國生物工程雜志雜志》2014年第七期

1方法

1．1病毒繁殖、純化及RNA抽提ibvH52毒株經(jīng)尿囊腔接種10dSPF雞胚增殖后，用PEG20000透析濃縮，經(jīng)SDS-PROK方法抽提RNA，直接進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄體系。

1．2RT-PCR和cDNA克隆參照報道IBVBeaudete株N基因序列設(shè)計一對引物［8］:引物P1:5''''GGATCCATGGCAAGCGGTAAAGCAG3''''，對應(yīng)于N基因ORF的1～19位，含BamHⅠ位點和ATG起始密碼子;引物P2:5''''CCGAGCTCTCAAAGTTCATTCTCTCC3''''，對應(yīng)于N基因ORF的1211～1230位，含SacⅠ位點和終止密碼子。引物由北京奧科生物公司合成，使用前稀釋成終濃度20mmol/L。RT-PCR以10μl病毒RNA為模板，按Promega公司cDNA合成說明書合成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增整個基因，反應(yīng)條件為94℃30s，50℃45s，72℃1min30s，35個循環(huán)后72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定后按試劑盒操作方法克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建pT-NP質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入E．coliDH5α克隆并用于測序。

1．3序列測定及分析重組質(zhì)粒經(jīng)北京奧科生物技術(shù)公司測序，然后將序列測定結(jié)果與GeneBank中的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分折。

1．4重組表達(dá)載體的構(gòu)建將pT-NP和pGEX-KG分別用BamHⅠ和SacⅠ酶切，回收1．2kb左右的N基因片段與用相同的酶消化的pGEX-KG片段，T4連接酶在16℃定向連接構(gòu)建GST融合表達(dá)載體pGEX-NP。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB瓊脂平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)，并對陽性進(jìn)行PCR及酶切分析鑒定。

1．5轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測純化將鑒定正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主菌E．coliBL21(DE3)進(jìn)行篩選誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)產(chǎn)物的提取按pGEX表達(dá)系統(tǒng)操作手冊進(jìn)行。表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳和Westernblot分析按參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行，目的蛋白的純化按Hi-TrapGST純化柱的操作說明進(jìn)行。

1．6間接ELISA方法的建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)最佳反應(yīng)條件的選擇:通過方陣滴定方法，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。抗原從1∶20稀釋到1∶640，血清從1∶10稀釋到1∶320，按其稀釋度分別加到酶標(biāo)板的1至6行和1至6列，陰性血清按陽性血清同樣的稀釋度加到第7至12列，按間接ELISA方法進(jìn)行操作，測定OD450值，計算陽性O(shè)D值比陰性O(shè)D值(P/N值)，結(jié)果最大的孔所對應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度，判為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定:將臨床未經(jīng)免疫的144份雞血清，進(jìn)行ELISA檢測，計算平均值x，標(biāo)準(zhǔn)差s，陰陽界限值按計算公式:x+3s確定。重復(fù)性試驗:用相同批次、不同批次的酶標(biāo)板，對抗體水平不同的6份血清樣品進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性測定，參照參考文獻(xiàn)［10］計算批內(nèi)、批間的吸收變異系數(shù)。交叉性試驗:分別檢AIV、NDV、IBDV、EDS76等禽常見病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，同時設(shè)陽性血清、陰性血清和空白對照。阻斷試驗:將IBVH52陽性的雞胚尿囊液與等體積IBV陽性血清混合，37℃作用45min，作倍比稀釋，ELISA檢測，同時設(shè)不做任何處理的正常尿囊液和陽性血清混合物作為對照。診斷特異性、敏感性與符合率試驗:選用國內(nèi)外公認(rèn)的檢測方法，即血凝抑制試驗(HI)作為參照試驗方法，與本研究建立的ELISA診斷方法相比較，確定該ELISA診斷方法的診斷特異性、敏感性與符合率。血凝抑制試驗(HI)按OIE手冊中方法進(jìn)行［11］。間接ELISA的應(yīng)用:用建立的ELISA方法檢測江夏、新洲、黃陂等地區(qū)臨床送檢的400份血清。

2結(jié)果

2．1N基因的克隆

RT-PCR產(chǎn)物電泳顯示，目的片段在1．2kb左右，將目的基因回收后連到pMD18-T載體轉(zhuǎn)入E．coliDH5α，提取質(zhì)粒，用BamHI和SacⅠ雙酶切切出1．2kb、2．7kb左右的兩條帶，用BamHI單酶切僅一條(圖1)，這說明所挑選的克隆產(chǎn)物為目的基因正向插入質(zhì)粒，其大小與預(yù)期一致。通過測序，測得N基因序列長度為1230bp，編碼409個氨基酸，涵蓋了從ATG至TGA一個完整的閱讀框。通過NCBIBLAST方法進(jìn)行分析，該基因與LKQ3(H52)毒株同源性最高，為97%，以上表明擴(kuò)增片段為目的基因。

2．2表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

將pGEX-NP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)，挑取單個菌落培養(yǎng)用于小量制備質(zhì)粒DNA，并通過酶切、PCR篩選正確插入目的基因的重組質(zhì)粒。結(jié)果顯示，BamHⅠ和SacⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳后可見清晰的1．2kb和4．9kb的2條帶;經(jīng)BamHI單酶切消化，電泳后可見一條大小約6．1kbDNA帶(圖2)。這說明我們獲得了正確插入目的基因的陽性克隆。

2．3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Westernblot分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示:含pGEX-KG的E．coliBL21的對照在約26kDa有明顯的表達(dá)帶，相當(dāng)于GST蛋白的大小，含重組質(zhì)粒pGEX-NP的大腸桿菌在約80kDa處有明顯的表達(dá)帶，相當(dāng)于N蛋白與GST蛋白融合表達(dá)的產(chǎn)物，結(jié)果表明目的基因在重組菌中獲得了表達(dá);經(jīng)掃描分析，在IPTG誘導(dǎo)3h左右的細(xì)菌中，該蛋白表達(dá)量占總蛋白量的25%，達(dá)到最高(圖3)。Westernblot分析表明:重組表達(dá)的80kDa蛋白帶，能與IBV的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，證實表達(dá)產(chǎn)物具有很好的免疫學(xué)活性(圖3)。

2．4NP-ELISA的建立與應(yīng)用

2．4．1NP-ELISA最適條件及陰陽界限的確定試驗表明抗原的最佳包被濃度為1．75μg/ml，抗原最佳稀釋度為1∶40，血清最佳稀釋度為1∶80，陰性血清平均OD值x等于0．178，s等于0．061，求得陰陽界限為x+3×s=0．178+3×0．061=0．361。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確立:以空白孔調(diào)零為背景，在酶標(biāo)儀上測各孔OD450值，若OD450≥0．361判為血清抗體陽性，表明疫苗免疫雞群產(chǎn)生了相關(guān)抗體或非免疫雞群受到了野毒的感染;若OD450＜0．361判為陰性。

2．4．2交叉性試驗結(jié)果表明無關(guān)病原抗體OD值均在臨界值0．361以下，說明此方法與AIV、IBDV、NDV、EDS76等病原抗體無交叉反應(yīng)，特異性強(表1)。

2．4．3重復(fù)性試驗結(jié)果表明批間重復(fù)的吸收變異系數(shù)在3．62%～9．49%之間，批內(nèi)重復(fù)的吸收變異系數(shù)在3．29%～7．97%之間，說明該診斷方法具有良好的重復(fù)性。2．4．4診斷特異性、敏感性與符合率試驗HI試驗和ELISA試驗檢測同一批血清的陰陽性結(jié)果如表2所示，結(jié)果顯示，以HI試驗作為參照，ELISA試驗的診斷敏感性為97．29%，特異性為60．60%，符合率為88．89%，說明該方法具有良好的診斷特異性、敏感性與符合率(表2)。2．4．5阻斷試驗可以看出經(jīng)含IBV的尿囊液處理的陽性血清OD值明顯降低，而經(jīng)健康雞胚尿囊液處理的陽性血清的OD值沒有明顯變化(圖4)。2．4．6間接ELISA在臨床的應(yīng)用統(tǒng)計表明，臨床樣品的陽性率為89．0%，這說明NP-ELISA方法能很好地應(yīng)用于臨床IBV抗體檢測(表3)。

3討論

核衣殼蛋白(N)是IBV的3種主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在遺傳進(jìn)化中最為保守，不同毒株間同源性最高(達(dá)94%～99%)，病毒感染過程中表達(dá)量最大(S∶M∶N3種蛋白的摩爾比為1∶6∶15)，與病毒的組裝和機體細(xì)胞免疫等方面有重要相關(guān)性，因此研究N蛋白基因的克隆表達(dá)對該病有重要的意義。本研究中，將外源基因插入在GST蛋白基因的下游，表達(dá)出可溶性的融合蛋白GST-NP，利用GST親和層析柱進(jìn)行了純化。高純度表達(dá)蛋白的獲得為ELISA檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)，特別是在克服動物體內(nèi)大腸桿菌抗體對檢測方法的干擾方面有重要的意義。純化的產(chǎn)物有兩種，一種蛋白表達(dá)量高，片段較大，為主要產(chǎn)物，另一種表達(dá)量較低，片段較短，是附帶產(chǎn)物，這與相關(guān)融合報道的情況相同，可能是蛋白表達(dá)時部分蛋白在C端提前終止或發(fā)生了降解。Westernblot分析與ELISA試驗均表明，純化后兩種主要表達(dá)蛋白均具有很好的免疫學(xué)生物活性。

用大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白取代原病毒作為診斷抗原，是診斷技術(shù)發(fā)展的一種趨勢，優(yōu)勢有以下幾點:首先，重組N蛋白具有良好的免疫原性，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)的Gray株N蛋白可與多種血清型IBV抗體發(fā)生良好反應(yīng)。其次，目前傳染性支氣管炎病毒的檢測方法有兩種，分別是病原學(xué)方法和血清學(xué)方法。N蛋白可作為抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測，保守性好，可以檢測各種血清型的抗體，不存在病原檢測中范圍狹窄的問題，具有更高可信度。再者，該蛋白易于制備純化，成本廉價，建立的檢測方法安全性好、診斷對象單一，準(zhǔn)確性高，從制備、應(yīng)用效果上均優(yōu)于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的N蛋白，該蛋白對將來IB新型疫苗的研制和IBV的消除必然有一定的意義。

為對ELISA方法的特異性、敏感性與符合率進(jìn)行評定，本實驗進(jìn)行交叉性、阻斷性、重復(fù)性試驗，同時將NP-ELISA診斷方法與血凝抑制試驗(HI)相比較，結(jié)果表明NP-ELISA檢測的敏感性、符合率很高，但特異性稍微偏低，這可能由于兩種方法的診斷原理和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同所致。首先，靈敏度不同，HI雖是一種比較公認(rèn)的檢測方法，但其靈敏度不高，而ELISA可達(dá)到血清中和試驗的2．3倍，AGP的188倍，具有很高靈敏度;其次，兩種方法檢測的對象不同，NP-ELISA專一性地檢測NP蛋白抗體，診斷對象單一，影響因素少，非特異性小，而HI則是檢測胰酶消化過的IB病毒，其中胰酶本身、鹽離子濃度、溫度等對血凝性都具有很大的影響，影響因素多，特異性差;再者，實驗穩(wěn)定性不同，ELISA可以通過一系列的量化方法控制反應(yīng)條件，而HI實驗極易受胰酶消化效果和病毒的類型等不可量化控制的條件影響。所以NP-ELISA與HI相比的特異性偏低，僅能表明本方法的敏感性比HI更高，穩(wěn)定性更好，更適合于動物免疫或感染后早期抗體監(jiān)測。

作者：李中華肖運才畢丁仁胡思順吳仁蔚單位：福建省動物疫病預(yù)防控制中心華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院